[发明专利]一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法

权利要求书

1.一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸；

S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本，采用PCR体系扩增EHP目的片段，并按梯度稀释进行定量PCR反应，获取不同梯度的Ct平均值，确定临界对照Ct值；

S3、对步骤S1提取的核酸样本进行定量PCR检测，获取荧光定量PCR扩增曲线；

S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。

2.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤S1具体步骤如下：

a.将样品与0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液混匀；

b.在样本中加入溶菌酶，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min；

c.4℃冷藏，静置30min；

d.在样本中加20％SDS，振荡处理15min；

e.离心，取上清；

f.在上清液中加入等体积酚-氯仿-异戊醇，12000r·min^-1离心10min，取上清液；

g.再加入等体积氯仿-异戊醇，12000r·min^-1离心10min，取上清液，重复该步骤1次；

h.加入0.6倍上清体积的异丙醇，-20℃放置1h,12000r·min^-1离心15min，弃去上清；

i.用70％乙醇清洗沉淀，12000r·min^-1离心5min，弃去上清，晾干5-10min，使用TE缓冲液溶解沉淀。

3.根据权利要求2所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤a中，所述样品为土样，步骤a具体为：称取土壤样品，加入0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液，振荡混匀。

4.根据权利要求2所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤a中，所述样品为水样，步骤a具体为：取水样，离心后弃去上清，用0.1mol/lPH8.0磷酸缓冲液重悬沉淀。

5.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤如下：

j.称取受到EHP感染的虾肉组织，置于1.5mL的EP管中，加入CTAB裂解液裂解，并于65℃水浴2h；

k.在样本中加等体积酚-氯仿-异戊醇，12000r·min^-1离心10min，取上清液；

l.加等体积氯仿-异戊醇，12000r·min^-1离心10min，取上清液；

m.加0.6倍上清体积的异丙醇，-20℃沉降1h,12000rpm离心15min，弃去上清；用70％乙醇清洗沉淀，12000r·min-1离心3min，弃去上清，晾干5-10min，使用TE缓冲液溶解沉淀DNA模板，在-20℃保藏备用；

n.采用PCR体系扩增目的EHP SSU rRNA片段；

o.将步骤n中得到的目的片段用2％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收；使用第EHP SSUrRNA片段，按照梯度稀释进行定量PCR。

6.根据权利要求5所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤n中，PCR体系为：

7.根据权利要求5所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤n中，扩增程序如下：

8.根据权利要求5所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤o中，每个梯度为在上一个梯度的基础上稀释10倍。

9.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤S3中，PCR反应程序如下：

激活溶解曲线。