[发明专利]一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法在审
申请号: | 202111582255.X | 申请日: | 2021-12-22 |
公开(公告)号: | CN114250316A | 公开(公告)日: | 2022-03-29 |
发明(设计)人: | 王永伟;金伟波;邱晴;黄雕;蒋文沁;唐玲燕;戚正梁;茅华华;陈夏月;阮关虎 | 申请(专利权)人: | 绍兴市水产技术推广中心;浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6895 | 分类号: | C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/10;C12N15/11 |
代理公司: | 绍兴锋行知识产权代理事务所(普通合伙) 33460 | 代理人: | 徐锋 |
地址: | 312000 *** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 养殖 水土 样本 检测 肝肠 方法 | ||
1.一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸;
S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本,采用PCR体系扩增EHP目的片段,并按梯度稀释进行定量PCR反应,获取不同梯度的Ct平均值,确定临界对照Ct值;
S3、对步骤S1提取的核酸样本进行定量PCR检测,获取荧光定量PCR扩增曲线;
S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。
2.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤S1具体步骤如下:
a.将样品与0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液混匀;
b.在样本中加入溶菌酶,使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min;
c.4℃冷藏,静置30min;
d.在样本中加20%SDS,振荡处理15min;
e.离心,取上清;
f.在上清液中加入等体积酚-氯仿-异戊醇,12000r·min-1离心10min,取上清液;
g.再加入等体积氯仿-异戊醇,12000r·min-1离心10min,取上清液,重复该步骤1次;
h.加入0.6倍上清体积的异丙醇,-20℃放置1h,12000r·min-1离心15min,弃去上清;
i.用70%乙醇清洗沉淀,12000r·min-1离心5min,弃去上清,晾干5-10min,使用TE缓冲液溶解沉淀。
3.根据权利要求2所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤a中,所述样品为土样,步骤a具体为:称取土壤样品,加入0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液,振荡混匀。
4.根据权利要求2所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤a中,所述样品为水样,步骤a具体为:取水样,离心后弃去上清,用0.1mol/lPH8.0磷酸缓冲液重悬沉淀。
5.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤S2的具体步骤如下:
j.称取受到EHP感染的虾肉组织,置于1.5mL的EP管中,加入CTAB裂解液裂解,并于65℃水浴2h;
k.在样本中加等体积酚-氯仿-异戊醇,12000r·min-1离心10min,取上清液;
l.加等体积氯仿-异戊醇,12000r·min-1离心10min,取上清液;
m.加0.6倍上清体积的异丙醇,-20℃沉降1h,12000rpm离心15min,弃去上清;用70%乙醇清洗沉淀,12000r·min-1离心3min,弃去上清,晾干5-10min,使用TE缓冲液溶解沉淀DNA模板,在-20℃保藏备用;
n.采用PCR体系扩增目的EHP SSU rRNA片段;
o.将步骤n中得到的目的片段用2%琼脂糖凝胶电泳分离,并回收;使用第EHP SSUrRNA片段,按照梯度稀释进行定量PCR。
6.根据权利要求5所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤n中,PCR体系为:
7.根据权利要求5所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤n中,扩增程序如下:
8.根据权利要求5所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤o中,每个梯度为在上一个梯度的基础上稀释10倍。
9.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法,其特征在于,所述步骤S3中,PCR反应程序如下:
激活溶解曲线。
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