[发明专利]一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法

说明书

本发明公开了一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，包括如下步骤：S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸；S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本，采用PCR体系扩增EHP目的片段，并按梯度稀释进行定量PCR反应，获取不同梯度的Ct平均值，确定临界对照Ct值；S3、对提取的核酸样本进行定量PCR检测，获取荧光定量PCR扩增曲线；S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。本发明可以针对养殖户的养殖环境，进行虾肝肠胞虫的病原检测，而且使用定量pcr检测具有更加灵敏和准确的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法。

背景技术

南美白对虾是目前世界上最重要的经济虾类之一，也是我国主要的水产养殖品种，具有巨大的经济效益。但是长期以来，白对虾养殖产业一直受到多种传染性疾病的威胁，虾肝肠胞虫就是一种严重的传染性疾病。

感染虾肝肠胞虫(EHP)的对虾会出现生长缓慢的症状甚至停滞生长，严重的会慢性死亡。一旦虾肝肠胞虫大范围流行会造成白对虾养殖产业严重的减产，对养殖户造成巨大的经济损伤。目前,EHP已经在全世界各地的虾养殖场中被检测到,而EHP流行已经对印度、泰国、中国、越南、马来西亚、印度尼西亚等亚洲各国的养殖虾业造成了严重的经济损失。

目前在针对虾肝肠胞虫的研究中，尚无能够有效防治虾肝肠胞虫的报道。因而，为了避免造成经济损失，虾肝肠胞虫的预防就显得极为重要。在此为基础，发展出了以套式PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)为主的检测方法。而且在养殖过程中通过优先选育无虾肝肠胞虫亲虾和虾苗、投喂维生素增强对虾体质等手段减少EHP的危害。但是虾肝肠胞虫本身是一种真菌类寄生虫，容易在自然环境中长期存活，一旦有养殖户出现虾肝肠胞虫感染的情况，就疾病反复的现象。因而针对养殖户养殖环境的虾肝肠胞虫疾病检测就显得极为重要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，以解决现有技术存在的技术问题。

为达成上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，包括如下步骤：

S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸；

S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本，采用PCR体系扩增EHP目的片段，并按梯度稀释进行定量PCR反应，获取不同梯度的Ct平均值，确定临界对照Ct值；

S3、对步骤S1提取的核酸样本进行定量PCR检测，获取荧光定量PCR扩增曲线；

S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。

进一步地，所述步骤S1具体步骤如下：

a.将样品与0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液混匀；

b.在样本中加入溶菌酶，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min；

c.4℃冷藏，静置30min；

d.在样本中加20％SDS，振荡处理15min；

e.离心，取上清；

f.在上清液中加入等体积酚-氯仿-异戊醇，12000r·min^-1离心10min，取上清液；

g.再加入等体积氯仿-异戊醇，12000r·min^-1离心10min，取上清液，重复该步骤1次；

h.加入0.6倍上清体积的异丙醇，-20℃放置1h,12000r·min^-1离心15min，弃去上清；