[发明专利]一种同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱法

权利要求书

1.同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制；(2)液液萃取处理样本；(3)采用高效液相色谱法进行定性定量测定。

2.按照权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(1)所述的标准品溶液的配制具体方法为：

用甲醇分别配制100.00μmol/L吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、2.00mmol/L吲哚丙酸(Indole-3-propionate，IPA)、200.00μmol/L吲哚(Indole，IND)标准品储备溶液；用50％甲醇配制1.50mmol/L硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate，3-INDS)标准品储备液，所有储备溶液置于-20℃冰箱保存，使用时将储备溶液用50％甲醇稀释至所需浓度，配制系列浓度标准工作液。

3.按照权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(2)所述的液液萃取的具体方法为：

取EDTA抗凝血浆300μL，加入10μL内标溶液，再加入萃取剂1100μL，涡旋混匀，于25℃150rpm振摇10min；13,300g离心15min，取上清，真空离心浓缩干燥后复溶于200μL流动相。

4.按照权利要求3所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的萃取剂为乙醚和乙酸乙酯的混合液，其体积比为3:5。

5.按照权利要求3所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述内标液为20.00mg/L甲萘酚的甲醇溶液，其具体配制方法为：

精密称取甲萘酚溶于甲醇，配置浓度为5.00g/L的甲萘酚储备溶液，使用时用50％甲醇稀释至所需浓度。

6.按照权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(3)所述色谱条件如下：

色谱柱：Shim-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm，4.6μm)；

流动相A：10mmol/LNaH₂PO₄溶液；

流动相B：甲醇；等度洗脱，流动相A的比例为40％；

流速：0.8mL/min；

柱温：30℃；

荧光检测器：采用程序检测波长；

进样量：20μL。

7.按照权利要求6所述的高效液相色谱方法，其特征在于,所述的程序检测波长为：

表1 波长程序表

8.按照权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(3)定性定量测定包括：根据待检测物质与标准品的保留时间一致，确定为目标吲哚类物质；以混合血浆加入待测物的浓度对待测物与内标的峰面积比值减去混合血浆待测物与内标峰面积的比值做线性回归，得到线性回归方程；将待检测大鼠血浆中待测物与内标的峰面积比值带入线性回归方程，计算相应浓度。