[发明专利]一种同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱法

说明书

本发明公开了一种同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱方法，属于检测技术领域，包括以下步骤：(1)标准品溶液的配制；(2)液液萃取处理样本；(3)采用高效液相色谱法进行定性定量测定。本发明方法使大鼠血浆中硫酸吲哚酚、吲哚乙酸、吲哚丙酸和吲哚充分提取分离，采用程序检测波长可实现大鼠血浆中含量差异较大的四种吲哚类物质同时定量检测，具有灵敏度高、重现性好、分析时间短、样本用量小等优点。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及同时检测大鼠血浆中硫酸吲哚酚、吲哚乙酸、吲哚丙酸和吲哚四种吲哚类物质的高效液相色谱方法。

背景技术

肠道菌群作为机体的一种重要“器官”，对宿主的健康起着至关重要的作用，它不仅帮助宿主从食物中获取营养和能量，还产生了许多代谢产物参与宿主的新陈代谢。在正常情况下肠道菌群与宿主及外部环境之间保持着动态平衡，一旦肠道菌群紊乱，平衡失衡，会引发宿主多种功能的丧失，如屏障功能、炎症和免疫功能丧失等，从而诱发疾病。

吲哚及其衍生物是色氨酸在肠道菌群作用下的代谢产物，可与芳烃受体相互作用，影响宿主的免疫、代谢和行为等。研究表明这些吲哚类物质与细菌感染、肠道炎症、癌症、糖尿病以及神经系统疾病等密切相关。因此，建立大鼠血浆中吲哚类物质的定性、定量的快速检测方法对研究疾病的发病机制具有极其重要的意义。

目前大鼠血浆吲哚类物质常见的检测方法是超高效液相色谱-质谱法，但此方法尚不能广泛普及。因此，开发一种简便的高效液相色谱同时检测大鼠血浆中多种吲哚类物质的方法具有重要价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立一种同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱方法，实现对大鼠血浆中四种含量差异较大的吲哚类物质同时定量检测，具有灵敏度高、重现性好、分析时间短、样本用量小等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明公开了一种同时检测大鼠血浆中吲哚类物质含量的高效液相色谱-荧光检测方法，包括以下步骤：(1)标准品溶液的配制；(2)液液萃取处理样本；(3)采用高效液相色谱法进行定性定量测定。

步骤(1)所述的标准品溶液的配制具体方法为：

用甲醇分别配制100.00μmol/L吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、2.00mmol/L吲哚丙酸(Indole-3-propionate，IPA)、200.00μmol/L吲哚(Indole，IND)标准品储备溶液，用50％甲醇配制1.50mmol/L硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate，3-INDS)标准品储备液，所有储备溶液置于-20℃冰箱保存，使用时将储备溶液用甲醇/水(50/50，v/v)稀释至所需浓度，配制系列浓度标准工作液。

步骤(2)所述的液液萃取的具体操作为：

取EDTA抗凝血浆300μL，加入10μL内标溶液，再加入萃取剂1100μL，涡旋混匀，于25℃150rpm振摇10min；13,300g离心15min，取上清，真空离心浓缩干燥后复溶于200μL流动相；

进一步的，所述萃取剂为乙醚和乙酸乙酯的混合液，其体积比为3:5；

进一步的，所述内标液为20.00mg/L甲萘酚的甲醇溶液。其具体配制方法为：

精密称取甲萘酚溶于甲醇，配置浓度为5.00g/L的甲萘酚储备溶液，使用时用50％甲醇稀释至所需浓度。

步骤(3)中液相色谱条件如下：

色谱柱：Shim-PackVP-ODS(150mm×4.6mm，4.6μm)；

流动相A：10mmol/LNaH₂PO₄溶液；