[发明专利]合成多肽和IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种合成多肽，其特征在于，由多肽N1、多肽N2、多肽N3中任意两种或三种混合得到；其中

多肽N1，其氨基酸序列为GKPTSVNVSVVLSDI，SEQ ID NO.1；

多肽N2，其氨基酸序列为TEEQRVNGFLQ，SEQ ID NO.2；

多肽N3，其氨基酸序列为LIRSTNKSHGKPT，SEQ ID NO.3。

2.如权利要求1所述的合成多肽，其特征在于，采用多肽N1和多肽N2分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N1和多肽N3分别与KLH进行耦联按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N2和多肽N3分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N1、多肽N2、多肽N3分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)：(0.25～3)混合。

3.如权利要求2所述的合成多肽，其特征在于，多肽N1和多肽N2按质量比1：1混合，或者多肽N1和多肽N3按质量比1：1混合，或者多肽N2和多肽N3按质量比1：1混合，或者多肽N1、多肽N2、多肽N3按质量比1：1：1混合。

4.IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

S1.制备权利要求1～3任一项所述的多肽N1、多肽N2、多肽N3中的任意两种或三种；

S2.将步骤S1中制备的多肽分别与KLH耦联，制备免疫原，按比例混合后注射入免疫动物的体内，得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清；

S3.对IgNAR恒定区多克隆抗体血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。

5.如权利要求4所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体过程为：

S21.将选取的多肽分别与KLH进行耦联制成免疫原；将耦联后的多肽按质量比混合得到合成多肽；

S22.初次免疫：将合成多肽与弗氏完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内；

S23.将合成多肽与弗氏不完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内，进行加强免疫若干次；

S24.最后一次免疫后，取免疫动物全血，收集得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清。

6.如权利要求5所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：合成多肽与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂以1：1等体积混合乳化；初次免疫的免疫剂量为1mg/只，加强免疫的免疫剂量为0.5mg/只；初次免疫后进行4～5次加强免疫，间隔2周免疫1次，最后一次免疫7～10天后采用股动脉取全血；所述的免疫动物为新西兰大白兔。

7.如权利要求4所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S3的具体过程为：

S31.取IgNAR恒定区多克隆抗体血清用PBS稀释后，加入proteinA，得到混合物，室温下孵育；

S32.将步骤S31的混合物转移至重力纯化柱中，使液体缓慢留出，并收集流穿液；

S33.用10～20倍柱体积的冰预冷的PBS加入重力纯化柱中，进行洗涤；

S34.用柠檬酸加入重力纯化柱中进行洗脱，收集洗脱液并用Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，即得到纯化好的多克隆抗体。

8.如权利要求7所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括步骤S35：

S35.抗体保存：将纯化好的多克隆抗体转移至超滤管中进行超滤，当超滤管中剩余0.5～1mL液体时加入PBS溶液，此过程重复3-4次，最后一次在液体剩余0.5～1mL时停止超滤，取出液体于-18℃～-20℃冰箱中保存备用；

步骤S31中，取1～2mL血清用PBS稀释10倍，加入1～2mLproteinA，室温孵育1.5～2.5小时；步骤S34中用10～15mL0.1M，pH 2.5的柠檬酸进行洗脱，收集洗脱液后立即用1MpH 8.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱液。