[发明专利]基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液和实时荧光定量PCR检测的引物对STp：

正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，

反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′。

2.根据权利要求1所述快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括氯化钙溶液、阴性对照品、阳性对照品；其中，

氯化钙溶液的使用浓度为20mmol/L，

阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，

阳性对照品为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311。

3.一种利用权利要求1所述试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)噬菌体生物扩增法检测

a.将沙门氏菌噬菌体T156悬液与待检测的样品混合，再加入氯化钙溶液，加入LB培养基补至1mL，得到培养物A；

b.将上述培养物A置于37℃恒温摇床培养60min，得到培养物B；

2)噬菌体的实时荧光定量PCR检测：

a.分别取上述培养物A和培养物B提取噬菌体DNA，并保存于-20℃；

b.以噬菌体的DNA为模板，利用引物对STp进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，引物对STp为：

正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，

反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；

c.根据两个PCR产物的Ct值的差值ΔCt定性判断样品中是否存在有活性的鼠伤寒沙门氏菌，判断依据为：

当ΔCt≥1时，认定为检测出沙门氏菌；

d.以菌液浓度为横坐标，ΔCt为纵坐标，制作标准曲线，定量分析食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的浓度。

4.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第a小步中，沙门氏菌噬菌体T156悬液与前处理样品按体积1:1混合，再加入同等体积的氯化钙溶液，其工作浓度为20mmol/L，且沙门氏菌噬菌体T156悬液的浓度为10⁵PFU/mL。

5.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第b小步中，培养物A置于37℃恒温摇床中振荡培养，培养时间为60min。

6.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中第a小步中，将培养物A和培养物B用热裂解的方式提取DNA作为模板，即提取噬菌体与宿主菌混合培养前后样品中的DNA作为模板。

7.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中第b小步中，PCR的反应体系如下：