[发明专利]基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法，所述试剂盒包括含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液，以及实时荧光定量PCR(qPCR)检测的引物对；噬菌体生物扩增联合qPCR方法对食品基质中的沙门氏菌的最低检出限为10CFU/mL，检测时间仅为3.5h，且能区分活菌和死菌。本发明为快速检测食品中沙门氏菌的污染提供了理论依据。

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella spp.)是引起食源性疾病的最常见的食源性致病菌之一，其感染人类造成的沙门氏菌病表现为呕吐、腹泻、发烧等症状，甚至导致死亡。研究表明，沙门氏菌主要通过食物感染人类，易污染肉、蛋、牛奶、水果、和蔬菜等食物。候海燕等人在2010-2016年间对江苏省淮安市的262份生牛肉样品进行沙门氏菌的检测，其中24份样品被检测出沙门氏菌，检出率高达9.16％。快速准确地检测食品基质中的沙门氏菌是防止食品污染的有效措施，能够显著降低沙门氏菌感染人类的几率。

传统培养法以其灵敏度高、检测结果准确、成本低等优势，被公认为检测病原菌的“金标准”，但是检测过程复杂繁琐且耗时，需要5-7d，难以满足病原菌快速检测的需求。基于噬菌体生物扩增的检测方法以其特有的优势用于病原微生物(包括沙门氏菌)检测的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法，该试剂盒利用鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156联合检测沙门氏菌，具有检测时间短、速度快、灵敏度高、成本低、特异性强、可以区分死菌和活菌的特点。

为实现上述目的，本发明公开了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液和实时荧光定量PCR检测的引物对STp；

其中，沙门氏菌噬菌体T156已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T156，于2020年7月6日将该噬菌体T156保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2020288。其中，该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体在申请号为202010712852.9、发明名称为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156及其应用的中国发明专利公开；

其中，所述引物对STp为：

正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，

反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；

进一步地，所述试剂盒还包括氯化钙溶液、阴性对照品、阳性对照品；其中，

氯化钙溶液的使用浓度为20mmol/L，

阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，

阳性对照品为鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311。

本发明提供了一种利用上述试剂盒检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

1)噬菌体生物扩增法检测

a.将沙门氏菌噬菌体T156悬液与待检测的样品混合，再加入氯化钙溶液，加入LB培养基补至1mL，得到培养物A；

b.将上述培养物置于37℃恒温摇床培养60min，得到培养物B；

2)噬菌体的实时荧光定量PCR检测：