[发明专利]快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量PCR的联合试剂盒及其方法在审
| 申请号： | 202111588284.7 | 申请日： | 2021-12-23 |
| 公开（公告）号： | CN114480731A | 公开（公告）日： | 2022-05-13 |
| 发明（设计）人： | 王小红;丁一峰;王佳;邵彦春;陈慕潇;朱文娟;王吉;龚云霞 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/14;C12Q1/06;C12N15/11 |
| 代理公司： | 武汉开元知识产权代理有限公司 42104 | 代理人： | 冯超;刘琳 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 快速 检测 金黄色 葡萄球菌 噬菌体 生物 扩增 实时 荧光 定量 pcr 联合 试剂盒 及其 方法 | ||
1.一种快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量PCR的联合试剂盒，其特征在于：所述联合试剂盒包括含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸盐缓冲液，
和实时荧光定量PCR检测的引物对tsp：
正向引物tsp-F：5’-TGCGTGCTATTCTAGGTGGA-3’；
反向引物tsp-R：5’-ACCACTTACCAAACCTCCGA-3’。
2.根据权利要求1所述联合试剂盒，其特征在于：所述联合试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、硫酸亚铁铵溶液和柠檬酸三钠溶液；其中，
阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；
阳性对照品为金黄色葡萄球菌，该菌为金黄色葡萄球菌ATCC 25923；
硫酸亚铁铵溶液浓度为25mM；
柠檬酸三钠溶液为10mM。
3.一种利用权利要求1所述联合试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)噬菌体生物扩增法检测
a.将金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311悬液与待检测的样品混合，37℃培养，得到培养物；
b.将培养物与硫酸亚铁铵溶液混合，并加入LB液体培养基并补至1mL中，37℃培养；然后加入柠檬酸三钠溶液；
c.将混合液离心，得到上清液，即为子代噬菌体；
2)子代噬菌体的实时荧光定量PCR检测：
a.将子代噬菌体提取DNA，并保存于-20℃；
b.以子代噬菌体的DNA为模板，利用引物对tsp进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，引物对tsp为：
正向引物tsp-F：5’-TGCGTGCTATTCTAGGTGGA-3’，
反向引物tsp-R：5’-ACCACTTACCAAACCTCCGA-3’；
c.PCR产物的Ct值与建立的标准曲线分析得到待检测的样品中金黄色葡萄球菌的含量。
4.根据权利要求3所述联合试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第a小步中，金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311悬液与前处理样品按体积1:1混合，且金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311悬液的浓度为107PFU/mL，前处理样品的浓度为108CFU/mL。
5.根据权利要求3所述联合试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第b小步中，培养物与硫酸亚铁铵溶液的按体积1:1混合，硫酸亚铁铵溶液浓度为25mM，培养时间为5min；
柠檬酸三钠溶液添加量为100μL/L，柠檬酸三钠溶液浓度为10mM。
6.根据权利要求3所述联合试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述步骤2)第b小步中，PCR的反应扩增体系如下：
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