[发明专利]快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量PCR的联合试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增‑实时荧光定量PCR的联合试剂盒及其方法，所述联合试剂盒包括含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸盐缓冲液和实时荧光定量PCR检测的引物对tsp；噬菌体生物扩增结合qPCR法检测食品基质中的金黄色葡萄球菌能达到较好的检测效果，检测限为10¹CFU/mL。与传统培养法相比，检测时间大大缩短，2～3h内完成样品的检测。本发明可为基于噬菌体生物扩增的金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立提供实验依据和理论基础。

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量PCR的联合试剂盒及其方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)为革兰氏阳性菌，呈球菌状，倾向于成簇排列，被描述为“葡萄状”。其广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及其它环境中，也存在于大多数健康个体的皮肤和粘膜(通常是鼻腔区域)的正常人类菌群中。金黄色葡萄球菌分布广泛，存在于空气、水、人和奶牛等畜禽动物及其排泄物中，这使得食物更容易被污染。据报道，由于金黄色葡萄球菌污染而引起的食源性疾病是全球性的健康问题。金黄色葡萄球菌引起的疾病是存在于人类中最常见的细菌感染之一，会引起人类多种感染和疾病，包括腹痛、腹泻、恶心、呕吐，严重者还会导致败血症，感染性心内膜炎甚至休克。近几十年来，在金黄色葡萄球菌的检测，预防和控制方面取得了一些进展，有效的金黄色葡萄球菌检测方法对于食品安全和人类健康是必要的。

噬菌体是缺乏自身代谢机制的小型病毒，其结构包括蛋白质衣壳及衣壳内的遗传物质，但是，它们能利用宿主细菌细胞进行繁殖。噬菌体在自然界中的分布非常广泛，是地球上最丰富和普遍存在的生物，据估计地球上有10³¹个噬菌体颗粒，在某些生态系统中，噬菌体的数量甚至可以超过细菌约十倍。噬菌体是一类可以感染细菌并在细菌内复制增殖的病毒，能特异性吸附宿主菌，因此，可以利用噬菌体和细菌之间的这种特异性关系开发出以噬菌体为基础的致病菌检测方法。不需要菌落培养的分子生物学方法在微生物检测中得到了长足的发展。分子生物学检测方法主要围绕聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)技术展开，PCR是即时诊断法中使用最广泛的基于核酸的技术，主要用于检测、鉴定和定量病原体或有益菌群，例如发酵微生物或益生菌。但是分子生物学方法具有以下缺点：

需要训练有素的实验操作人员、需要使用放射性材料或有很大的交叉污染的可能性。最主要的是由于非存活或“死”细胞的扩增而导致的假阳性结果。

噬菌体生物扩增方法(Phage Amplification Assay，PAA)是一种通过检测裂解性噬菌体特异性吸附并侵染宿主细胞后将其裂解释放出的子代噬菌体，从而间接检测目标细菌的方法。噬菌体生物扩增法的关键点是选择用于噬菌体颗粒的失活的杀病毒剂的功效，因为任何残留的游离噬菌体通过感染所添加的辅助细胞将产生假阳性结果。1998年Stewart等人首次将噬菌体生物扩增法用于快速检测和鉴定特定细菌，使用石榴外皮提取物(PRE)与硫酸亚铁组合作为灭病毒剂，能在4h内分别检测出40CFU/mL的铜绿假单胞菌和600CFU/mL的沙门氏菌。但传统的噬菌体生物扩增法通过观察子代噬菌体在琼脂平板上形成的噬菌斑间接检测病原菌的存在，但噬菌斑形成过程所需时间一般为3-4h，耗时较久。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量PCR的联合试剂盒及其方法，该联合试剂盒利用金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311联合检测金黄色葡萄球菌，检测限为10¹CFU/mL，其具有速度快、灵敏度高、成本低、特异性强、可以区分死菌和活菌的特点。

为实现上述目的，本发明所设计一种快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量PCR的联合试剂盒，所述联合试剂盒包括含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸盐(phosphate buffered saline,PBS)缓冲液，