[发明专利]一种体外培养TH1细胞的培养液及其应用和TH1细胞的体外培养方法

说明书

本发明涉及免疫细胞治疗领域，特别是涉及一种体外培养TH1细胞的培养液及其应用和TH1细胞的体外培养方法。本发明在开始培养细胞的当天加入单抗CD3、单抗CD28的同时加入CpG‑A ODN、维生素A、肝素、γ‑分泌酶抑制剂DAPT、大蒜新素、IL‑18、IL‑12、IL‑2，能够诱导TH1细胞活化与增殖；在培养过程中不断添加含肝素、IL‑18、IL‑12、IL‑2的无血清培养基，可以进一步促进TH1细胞的生长和增殖，提高TH1细胞的数量，同时使扩增得到的TH细胞保持较好的细胞活性，提高TH1细胞的临床价值。本发明提供的培养液和对应的培养方法能够有效提高体外培养TH1细胞的数量和质量。

技术领域

本发明涉及免疫细胞治疗领域，特别是涉及一种体外培养TH1细胞的培养液及其应用和TH1细胞的体外培养方法。

背景技术

辅助性T细胞(helper T cell，Th)1作为最早发现的一类CD4+辅助性T细胞亚群，具有促进细胞免疫、增强抗肿瘤作用，它的增殖分化受肿瘤微环境和多种免疫细胞的共同调控，参与各种肿瘤免疫，越来越多的治疗方案被应用于临床，对肿瘤治疗的发展发挥重要作用。

Th1细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的形成，故亦称为炎症性T细胞，可被视为相当于TDTH细胞。Th1细胞在抗胞内病原体(病毒、细菌及寄生虫等)感染中发挥重要作用。在胞内细菌感染时，Th1细胞优先发育并引发吞噬细胞介导的宿主防御应答。Th1细胞持续性强应答，可能与器官特异性自身免疫病、接触性皮炎、不明原因的慢性炎症性疾病、迟发型超敏反应等有关。

有研究表明，TH1细胞的分化受多种因素的影响，如转录激活因子(STAT)4、T-bet、干扰素调节因子(IRF)1等转录因子，如IL-12、干扰素(IFN)-γ.IL-27和共刺激分子等都是影响Th1细胞分化的重要调控因素.除此之外，免疫细胞如树突状细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞以及其他免疫细胞在Thl的分化过程中有重要作用。

目前，现有技术一般通过以下两种不同方式获得TH1细胞：一是通过磁珠分离或流式细胞术(FACS)分选出部分T细胞(例如，Naive CD4+T细胞)，然后使这些细胞进行体外活化并分化成特定的Th1亚群，该方法虽然能得到较高纯度的TH1细胞，但成本较高，且由于使用磁珠或流式分选，对于后续用于临床治疗存在风险；二是直接从外周血分离PBMC，加入抗CD3和抗CD28抗体、IL-12诱导TH1细胞，该种方法操作简便，但得到的TH1细胞纯度较低，难以满足用于临床治疗的需要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种体外培养TH1细胞的培养液及其应用和TH1细胞的体外培养方法。本发明提供的培养液及配套的培养方法能够有效提高体外培养所获得的TH1细胞的纯度、数量和安全性。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种体外培养TH1细胞的培养液，所述培养液包括A培养液和B培养液；

所述A培养液包括以下浓度的组分：单抗CD3 500～1000ng/mL、单抗CD28 500～1000ng/mL、CpG-A ODN 0.05～3nmol/mL、维生素A 0.5～2μmol/mL、γ-分泌酶抑制剂DAPT20～100nmol/mL、大蒜新素50～150ng/mL、肝素10～100IU/mL、IL-18 10～50IU/mL、IL-1250～200IU/mL和IL-2 100～1000IU/mL；

所述B培养液包括无血清培养基和有效物质，所述有效物质包括以下浓度的组分：肝素10～100IU/mL、IL-18 10～50IU/mL、IL-12 50～200IU/mL、IL-2 100～1000IU/mL。

优选的，所述无血清培养基包括ALyS505N-0。

本发明还提供了上述培养液在体外培养TH1细胞中的应用。