[发明专利]一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒，其特征在于，包括CRISPR/Cas13a系统、枝状杂交链式反应体系和SERS检测芯片三部分；

所述CRISPR/Cas13a系统包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP；

所述枝状杂交链式反应体系包括修饰有染料分子ROX的发夹型DNA单链H1，发夹型DNA单链H2和H3；

所述SERS检测芯片为表面修饰有捕获单链C的银纳米棒阵列基片；

所述crRNA碱基序列如SEQ ID NO：2所示：

crRNA：5’- GAC CAC CCC AAA AAU GAA GGG GAC UAA AAC CUA CCU GCA CUG UAA GCACUU UU -3’；

所述尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的碱基序列如SEQ ID NO：3所示：

RP：5’-ACT ACC ATG ATC /rU//rU//rU/ /rU//rU//rU/ GTT AGA TCT CCA GTT ATCATG GTA GTT GGA -3’；

所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：4所示：

H1：5’- ROX- TCC AGT TAT CAT GTT AAG CGA TGA TAA CTG GAG ATC TAA C -3’；

所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：5所示：

H2：5’- CGC TTA ACA TGA TAA CTG GAG TTA GAT CTC CAG TTA TCA TTG CGG TGACAC GGC AGT TAG A -3’；

所述发夹型DNA单链H3的碱基序列如SEQ ID NO：6所示：

H3：5’- TCT AAC TGC CGT GTC ACC GCA GTT AGA TCT CCA GTT ATC AT -3’；

所述捕获单链C的碱基序列如SEQ ID NO：7所示：

C：5’- SH-(CH₂)₆ -TTT TTT TTT TTC CAA CTA CC -3’。

2.权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）CRISPR/Cas13a系统的制备：包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的制备；

所述Cas13a蛋白与crRNA的浓度为0.1~1 μM，所述尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的浓度为1~10 μM；

（二）枝状杂交链式反应体系的制备：包括修饰有染料分子ROX的发夹型DNA单链H1，发夹型DNA单链H2和H3的制备；

所述的发夹型DNA单链H1、H2和H3的浓度为5~20 μM；

（三）SERS检测芯片制备：

（1）制备银纳米棒阵列并用DEPC处理水多次冲洗；

（2）将银纳米棒阵列和20 μL 0.5~2 μM 捕获单链C溶液共培养，捕获单链C通过巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面；

培养条件：25~37℃，60~80%湿度环境中静置3~5小时；

（3）使用反应缓冲液清洗基片后，将20 μL 1~100 μM 6-巯基己醇滴加至上述基片表面置于37℃恒温混匀仪中反应20分钟；

（4）依次用反应缓冲液和DEPC处理水多次清洗基片，得到SERS检测芯片。

3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒的制备方法，其特征在于：反应缓冲液是10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1.5 mM MgCl₂，pH 8.3。

4.权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒用于检测血清中微小核酸microRNA的应用，所述的应用是非疾病诊断目的的。