[发明专利]一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用。该试剂盒包括检测体系和SERS检测芯片，检测体系包括Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链和三个发夹型DNA单链，SERS检测芯片为表面修饰有DNA单链的银纳米棒阵列基片。将Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链、三个发夹型DNA单链与待检测RNA样品混合，并滴加在SERS检测芯片表面，借助级联的CRISPR/Cas13a系统的信号放大和发夹型DNA单链产生的枝状杂交链式反应信号策略及检测芯片的SERS增强性能，通过测试芯片上染料分子ROX的拉曼信号，实现RNA的快速（60分钟内）、高灵敏度（2.62 aM）和高特异性（识别单碱基突变）检测。

技术领域

本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒、其制备方法与应用。

背景技术

分子诊断技术，特别是在肿瘤、传染病和遗传病等领域，已经成为疾病鉴定、评估、预防以及治疗方面的强有力工具。对生物样品中极微量的核酸标志物进行高灵敏和特异性检测是一项巨大的挑战。为了满足可靠且高灵敏检测的需求，一个可行的解决方案是对极微量的待检测核酸进行扩增。近年来，实时聚合酶链式反应(RT-PCR)被认为是一种典型的核酸扩增策略，它通过目标核酸在聚合酶作用下的连续复制实现了高灵敏检测。此外，核酸等温扩增技术，诸如环介导等温扩增技术(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)，被称为是可以替代传统PCR的核酸检测技术。然而，这些基于核酸扩增的检测技术受限于精确的引物设计、精细的热控制及复杂的操作等要求，使得检测成本高、耗时长，且容易受到污染造成假阳性。因此，发展无需核酸扩增的检测技术具有重要意义。

目前，无酶信号放大策略由于其简单、稳健、高效的检测，且无需核酸扩增即可产生明显的信号放大而受到广泛关注。然而，几乎所有的无酶信号放大策略都不如常规 PCR具有一般10⁷～10⁸扩增倍数的灵敏性，由于其有限的信号放大能力和自发杂交产生的非特异性问题，极大限制了其在液体活检和病原体检测方面的应用。而最近发现的簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白系统为构建新型核酸检测体系提供了可能性。已经有研究证实了CRISPR/Cas13a系统可特异性识别目标RNA，随后激活Cas13a的RNA酶切活性，非特异性地切割特定的核酸探针。此外，这种RNA 酶切效率高效，每识别一个目标RNA至少有10⁴次周转量，导致信号放大4个数量级。此外，基于高灵敏的表面增强拉曼散射(SERS)技术开发传感策略，可以获得更灵敏的检测能力，有望取代传统基于荧光的检测方法而具有广阔的应用前景。

因此，开发一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒用于检测RNA及其简便的制备及应用技术，可实现快速、便捷、特异性、高灵敏核酸检测，对于生物样本中极低丰度的RNA快速、可靠检测具有重要意义和应用价值。

公开号为CN111270012B的授权专利涉及一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统，实现对于新型冠状病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测。本申请主题也是涉及“检测疾病相关核酸标志物”，基于判例法，本发明不属于专利法25条不授予专利权的内容。

发明内容

发明目的：针对当前核酸分子尤其是疾病相关核酸标志物的快速灵敏测定的重大需求，以及传统基于核酸扩增检测技术在灵敏度、特异性、重现性和时效性等方面的不足，本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒、其制备方法与应用。该检测试剂盒制备及应用简单，可在60分钟内实现阿摩尔每升量级的高灵敏检测，能够在复杂环境高特异性的检测目标RNA并能够区分核酸分子单碱基差异，具有优异的特异性、均一性和重现性，具备检测核酸分子的强大能力，在核酸分子检测领域具有重要的应用前景。