[发明专利]一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测多个单核苷酸多态性的方法，所述检测方法用于非疾病治疗诊断目的，其特征在于，包括如下步骤：

S1：根据靶标基因位点序列，分别设计每种所述靶标基因位点的特异性上游引物、下游引物和探针序列；针对每个靶标基因设计两条邻近单标记探针，即一条3’端标记淬灭基团的探针P1，另一条邻近的5’端标记荧光基团且3’端磷酸化封闭处理的探针P2，且探针P1的长度长于探针P2；

S2：采集血液样本并提取DNA，测定DNA浓度及纯度，DNA样本中OD260/OD280的值应在1.8~2.0，浓度应在10~100ng/μl之间，将质检合格的DNA样本保存备用；

S3：配制多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括每种靶标基因的特异性探针、每种靶标基因的特异性上游引物和下游引物，多重PCR反应体系中引物、探针的用量比例为：上游引物：下游引物：单标记探针P1：单标记探针P2＝4:4:2:1；

S4：进行PCR对称扩增，扩增过程在一个反应管内进行，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析，根据熔解峰Tm值的差异及荧光通道类型判断单核苷酸的基因型；

步骤S1中，所述靶标基因位点包括ACE基因的rs4646994位点、CYP2D6*10基因的rs1065852位点、ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点；

步骤S3中，所述特异性上游引物、下游引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示，所述特异性探针序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20所示；

所述特异性探针序列中，SEQ ID NO.11所示探针的3’端标记BHQ3，SEQ ID NO.12所示探针的5’端标记CY5，3’端磷酸化，SEQ ID NO.13所示探针的3’端标记BHQ1，SEQ ID NO.14所示探针的5’端标记VIC，3’端磷酸化，SEQ ID NO.15所示探针的3’端标记BHQ1，SEQ IDNO.16所示探针的5’端标记FAM，3’端磷酸化，SEQ ID NO.17所示探针的3’端标记BHQ2，SEQID NO.18所示探针的5’端标记ROX，3’端磷酸化，SEQ ID NO.19所示探针的3’端标记BHQ2，SEQ ID NO.20所示探针的5’端标记ROX，3’端磷酸化；

步骤S4中，基于引物对称扩增的方式获得双链扩增产物，通过快速降温的方式获得单链杂交产物，降温速率介于0.1℃/s～4℃/s，熔解曲线程序为：95℃保持1min，43℃～73℃升温并以0.04℃/s～0.06℃/s的升温速度采集荧光信号。

2.一种检测多个单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于高血压用药相关基因的检测，包含下述1)～5）中5组引物探针组合：

1）检测ACE基因的rs4646994位点的引物SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2及探针序列SEQID NO.11～SEQ ID NO.12，其中SEQ ID NO.11所示探针的3’端标记BHQ3，SEQ ID NO.12所示探针的5’端标记CY5，3’端磷酸化；

2）检测CYP2D6*10基因的rs1065852位点的引物SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4及探针序列SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14，其中SEQ ID NO.13所示探针的3’端标记BHQ1，SEQ IDNO.14所示探针的5’端标记VIC，3’端磷酸化；

3）检测ADRB1基因的rs1801253位点的引物SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6及探针序列SEQID NO.15～SEQ ID NO.16，其中SEQ ID NO.15所示探针的3’端标记BHQ1，SEQ ID NO.16所示探针的5’端标记FAM，3’端磷酸化；

4）检测AGTR1基因的rs5186位点的引物SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8及探针序列SEQ IDNO.17～SEQ ID NO.18，其中SEQ ID NO.17所示探针的3’端标记BHQ2，SEQ ID NO.18所示探针的5’端标记ROX，3’端磷酸化；

5）检测CYP2C9*3基因的rs1057910位点的引物SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10及探针序列SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20，其中SEQ ID NO.19所示探针的3’端标记BHQ2，SEQ IDNO.20所示探针的5’端标记ROX，3’端磷酸化。