[发明专利]一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了提供一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域，该方法主要包括：根据靶标基因序列，设计上游引物、下游引物和两条邻近单标记探针，配制多重PCR反应体系，采用引物对称扩增方式进行扩增，然后进行熔解曲线分析。本发明利用两条邻近单标记探针与靶标结合/解离状态下的荧光信号差异，增强区分SNP等位基因的能力，使多重PCR的判读更加清晰。本发明通过引物对称扩增+快速降温的方式获得单链扩增产物，能有效降低多重引物体系间的扩增效率差异，解决高GC模板扩增问题。本发明方法突破多个单核苷酸多态性检测的技术瓶颈，为临床提供一种结果稳定、判读简单、通量高、周期短、成本低的多重SNP检测方法。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体为一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒 及其应用。

背景技术

原发性高血压病是最常见的慢性疾病之一，是导致冠心病、脑卒中等心血管疾病的重 要危险因子，大量的研究证明，原发性高血压病主要受遗传因素和环境因素的共同影响。 目前临床常用的降压药物包括利尿剂、β肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和α肾上腺素受体阻滞剂，然而，在临床治疗高血压的药物在个体反应差异十分普遍，主要原因是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。目前市场上拿证的PCR类试剂盒及相关专利都需要通过至少3个反应管才能完成对高血压用药相关基因CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE5个SNP基因多态性位点的检测， 检测成本高、检测效率低，限制了高血压精准用药的临床大规模推广。

目前对单核苷酸多态性的检测，常见的方法有直接测序法、基因芯片杂交法、MALDI-TOFMS质谱技术、PCR-TaqmanMGB探针分型法、ARMS-PCR法、PCR高分辨率 熔解曲线法等，这些方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生 污染，产生一定假阴性和假阳性等缺陷。

直接测序法，是SNP位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪 器昂贵，推广困难。另外直接测序对模板量要求高，通常需要通过PCR扩增富集目的片段后，进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。

基因芯片杂交法，该检测方法仍然存在操作复杂，开管操作，易造成污染的问题，另 外杂交芯片制作复杂，需要载玻片等耗材，大大提高了检测成本。整个检测周期需要3-4个小时，效率不高。

MassARRAY核酸质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易 受到样本因素的多种干扰，精确度难以保证。检测过程需要多点质控，否则精确度很低。 另外，很重要的一点是这个检测PCR过程和质谱过程是分开的，PCR需要自己做，并不便宜。

PCR-Taqman MGB探针分型法，因其操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期短等特点，是目前比较主流的SNP分型方法。然而由于仪器采集信号通道的限制，每次反 应都只能检测有限几个SNP位点，通量较低，而采取多管检测的时候又会极大增加检测的 经济成本和时间成本；另外该技术需要两条Taqman-MGB探针，而MGB探针的合成价格 是普通Taqman探针的几倍，大大增加了检测成本，且MGB探针属于美国LIFE公司专利 技术，会在原材料上受到较多限制。

ARMS-PCR，扩增阻滞突变系统PCR，又称为等位基因特异性PCR，用于对已知突变基因进行检测。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位 基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。目前市场主 流为ARMS+qPCR技术，采用TaqMan探针进行检测。该技术具有操作简单，时间快速， 灵敏度高，可检测低至1％的突变，成本较低(LDT)，缺点是检测通量较低，不能检测未 知突变，另外结果判读复杂，需要在qPCR上通过CT值进行判断，同时不适于位点附近 GC含量过高或过低的SNP的分型检测。