[发明专利]一种皮肤衰老蛋白标志物—SPIT1蛋白及其无创性提取方法

权利要求书

1.一种无创提取皮肤中SPIT1蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：表皮皮肤样本中SPIT1蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过USPIT1蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B；176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

3.根据权利要求2所述的SPIT1蛋白测定方法，其特征在于：用于检测SPIT1蛋白含量的物质为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；所述用于检测SPIT1蛋白含量的物质为轨道阱高分辨率质谱仪。