[发明专利]一种皮肤衰老蛋白标志物—SPIT1蛋白及其无创性提取方法

说明书

本发明公开了一种皮肤衰老蛋白标志物—SPIT1蛋白及其无创性提取方法。公开了SPIT1蛋白在辅助判断衰老程度中的应用及提取检测方法，旨在从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外可以正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，为美容或者医学美容提供参考和方向。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种皮肤衰老蛋白标志物—SPIT1蛋白及其无创性提取方法。

背景技术

皮肤老化，也即皮肤衰老，是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化。表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化。表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。

随着人们生活水平的提高，人们越来越重视皮肤保养，但通常只是关注皮肤衰老的外在表现，比如皱纹、色斑、以及毛孔粗细程度等信息，并由此来判断皮肤的衰老程度，这种判断皮肤衰老程度的方法不能从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，无法在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，也是美容或者医学美容的前提。

SPINT1(SPIT1)充当HSP90AA1的伴侣。介导分子伴侣HSPA8/HSC70和HSP90的缔合。能与分子伴侣结合；分别可与Hsp70蛋白、Hsp90蛋白、蛋白C末端、RNA结合。在生物过程中能细胞对白介素7的反应。酶和途径数据库中编码P31948，反应组编码R-HSA-3371497，用于类固醇激素受体(SHR)的HSP90伴侣周期。辅助生物活动生命过程。SPINT1，也称为1型HGF激活剂(HGFA)抑制剂(HAI-1)，是可在大多数上皮细胞表面表达的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。SPINT1-ST14轴可调节炎症，SPINT1水平可严格调节肿瘤与免疫细胞的串扰。SPINT1水平过低会导致肿瘤细胞与其微环境之间的串扰不平衡，从而促进较高的SKCM(皮肤黑素细胞瘤)侵袭性。此外，研究发现小鼠肠道特异性Spint1的缺失会诱导小鼠肠道的激活主要炎症转录因子NF-κB和加速肠道肿瘤形成。缺乏Spint1的小鼠表现出严重的生长迟缓，并且无法在出生后第16天生存。这些小鼠在组织学上表现为表皮过度角化和棘皮症，以及与异常角质层发育相关的发育不足。因此认为SPINT1对于维持免疫稳态，抑制肿瘤发生发展以及促进皮肤正常增殖起到重要作用。

目前没有将SPIT1蛋白(Kunitz型蛋白酶抑制剂1)用于辅助判断皮肤衰老程度的先例。

发明内容

一种无创提取皮肤中SPIT1蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。