[发明专利]基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的夹心型电化学传感器双信号检测GP73的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的基于H-rGO-Mn₃O₄纳米酶的夹心型电化学传感器双信号检测GP73的方法，按以下步骤进行：

步骤1：H-rGO的制备

将制备好的rGO与Hemin以1:1比例混合，水浴反应，离心洗涤，得到H-rGO纳米复合材料；

其特征在于，还包括以下步骤：

步骤2：H-rGO-Mn₃O₄-Apt1检测探针的制备

在超纯水中加入MnCl₂·4H₂O粉末和PVP，室温下搅拌均匀，加热，搅拌条件下加入NaOH溶液，搅拌，离心，洗涤，得到Mn₃O₄溶液；然后，将NHS/EDC添加到H-rGO溶液中，在室温搅拌条件下添加Mn₃O₄溶液，搅拌，离心，洗涤，得到H-rGO-Mn₃O₄纳米酶；取Apt1和H-rGO-Mn₃O₄纳米酶溶液超声震荡混合，孵育，离心，洗涤，得H-rGO-Mn₃O₄-Apt1检测探针；

步骤3：电化学传感界面的构建

（1）SPE在置放在 H₂SO₄溶液，采用循环伏安法（CV）扫描，冲洗，干燥，得到活化的SPE；

（2）将OPD与HAuCl₄混合，将活化后的SPE沉入混合溶液中采用i-t技术进行恒电位沉积，洗涤，吹干，得到Au@POPD/SPE；

（3）在Au@POPD/SPE表面滴加EDC/NHS进行活化；

（4）在Au@POPD/SPE上滴加Apt2，孵育，洗涤，吹干，得到Apt2/Au@POPD/SPE；

（5）将BSA溶液添加到Apt2/Au@POPD/SPE表面，孵育，阻断非特异性结合位点，洗涤，吹干备用；

步骤4：GP73标准曲线的绘制

（1）在步骤2得到的电化学传感界面上滴加标准GP73样品，孵育，得到GP73/Apt2/Au@POPD/SPE；

（2）在GP73/Apt2/Au@POPD/SPE表面滴加H-rGO-Mn₃O₄-Apt1溶液，孵育，得到工作电极H-rGO-Mn₃O₄-Apt1/GP73/Apt2/Au@POPD/SPE；

（3）将所制备好的工作电极置入包含H₂O₂和TMB的PBS缓冲液中，采用SWV进行扫描，记录传感器的响应电流变化；

（4）分别对不同浓度的GP73进行检测，记录峰电流，根据峰电流和GP73浓度的关系绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；

步骤5：实际样品中GP73的检测

（1）将正常人血清样本与GP73标准溶液混合，制成混合液，滴加在步骤2制备的传感界面，再滴加检测探针，孵育洗涤，得到工作电极，晾干备用；

（2）将工作电极放入包含H₂O₂和TMB的PBS缓冲液中，采用SWV进行扫描，记录传感器的响应电流值；

（3）根据步骤3所得的工作曲线，计算待测实际血清样本中GP73的浓度。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中所述的Apt1浓度为5.0 μM，H-rGO-Mn₃O₄纳米酶浓度为1.0 mg/mL。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中所述EDC/NHS以体积比为1:1进行混合。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中HAuCl₄与OPD的比例为1:3。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4和步骤5中所述TMB与H₂O₂的混合体积比为2:1。