[发明专利]基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的夹心型电化学传感器双信号检测GP73的方法

说明书

基于H‑rGO‑Mn3O4纳米酶的夹心型电化学传感器双信号检测GP73的方法，首先制备H‑rGO‑Mn3O4纳米酶材料，设计了H‑rGO‑Mn3O4纳米酶和Au@POPD夹心型适配体传感器；该传感器用于固定氨基功能化的Apt1，由于氯化血红素(Fe(Ш)/hemin(Fe(II))之间的氧化还原反应，还用作原位信号指示剂；TMB作为另一种信号探针，当靶标存在时，适配体特异性结合靶标，从而产生两种电化学信号。两种电化学信号在0.01‑100 ng/mL范围内具有良好的线性关系，实现双信号检测GP73，检测限为0.01 ng/mL，检测灵敏度为2.441µA/µM/cm²。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于复合纳米酶材料检测GP73的方法。

背景技术

高尔基体蛋白73（GP73）是一种具有402个氨基酸、相对分子量为73kDa的跨膜糖蛋白。目前常用的GP73检测方法为酶联免疫吸附测定法（ELISA）。公开号CN 111413502 A的发明专利，涉及一种采用商业ELISA试剂盒血清检测GP73的方法，但该方法所用试剂盒价格较贵，操作时间长。公开号CN 109212192 A的发明专利，涉及一种基于磁微粒化学发光法平台制备的试剂盒检测GP73的方法，但该方法使用了辣根过氧化物酶对抗体进行标记，增加了制作成本。因此，需要建立一种低成本，快速、操作简便的GP73检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于血红素-还原氧化石墨烯-四氧化三猛（H-rGO-Mn₃O₄）纳米酶和纳米金粒子@聚邻苯二胺（Au@POPD）纳米杂化物构建夹心型电化学传感器以及采用该传感器双信号检测GP73的方法。

为了解决该技术问题，利用RGO的高比表面积和高电子转移效率、Hemin的过氧化物酶性能以及纳米Mn₃O₄粒子的优异催化性能，通过协同作用形成具有高效类过氧化物酶性能的H-rGO-Mn₃O₄纳米酶，H-rGO-Mn₃O₄纳米酶不仅用于固定氨基功能化的 GP73适配体 1(Apt1)，而且由于 Hemin中Fe²⁺与Fe³⁺之间的可逆氧化还原反应引起电流信号的变化，因此还用作原位信号指示剂。Au@POPD纳米杂化物装饰在丝网印刷电极 (SPE) 表面以捕获GP73适配体2 (Apt2)。当GP73存在时，Apt1和Apt2同时特异性识别GP73，从而成功设计了夹心型适配体传感器。将该夹心型适配体传感器置于含有H₂O₂和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的磷酸盐缓冲液PBS中，催化H₂O₂分解产生大量的O₂，TMB在氧气的存在下氧化为oxTMB产生电流信号，作为另一种信号探针，采用方波伏安法（SWV）同时记录两种电流信号，然后根据GP73浓度和传感器的响应电流关系绘制出工作曲线，实现对GP73的电化学检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：血红素-还原氧化石墨烯（H-rGO）纳米复合材料的制备

（1）还原性氧化石墨烯（rGO）的制备

称取氧化石墨烯（GO）置于超纯水中，破碎溶解；随后加入抗坏血酸（AA），搅拌还原，得还原性氧化石墨烯（rGO）溶液。

（2）H-rGO的制备

称取血红素（Hemin）用氨水和超纯水溶解均匀，加入rGO溶液，再向其中加入水合肼溶液，搅拌，水浴，离心、洗涤，即得H-rGO复合纳米材料。

作为改进，还包括以下步骤：

步骤2：H-rGO-Mn₃O₄-Apt1检测探针的制备：