[发明专利]一种细胞外RNA文库的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 202111596366.6 | 申请日： | 2021-12-24 |
| 公开（公告）号： | CN115109835A | 公开（公告）日： | 2022-09-27 |
| 发明（设计）人： | 杨学敏;张燕菲 | 申请（专利权）人： | 广州表观生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B40/06;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙) 11463 | 代理人： | 王忠宝 |
| 地址： | 510700 广东省广州市黄埔区科*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 细胞 rna 文库 构建 方法 及其 应用 | ||
1.一种细胞外RNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)裂解体液样本；
(b)加入含有标签序列的磁珠捕获所述体液样本中的RNA；
(c)逆转录；
(d)以第一链cDNA为模板，合成第二链cDNA；
(e)获得的第二链cDNA经去核糖体RNA后进行PCR富集获得全转录组检测文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使用裂解液裂解体液样本，所述裂解液主要包含以下成分：80～120mM的Tris-HCl；体积浓度0.8％～1.2％的LiDS；450～550mM的LiCl；以及7.5～15mM的DTT，质量体积分数4-6％的Ficoll。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(b)中，含有标签序列的磁珠包括5’通用接头序列-barcode-TTTTTTTTTTTTTTTTNNNNN+N-3’、、5’通用接头序列-barcode-TTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’、5’通用接头序列-barcode-NNNNNN/SpC6/、5’通用接头序列-barcode-基因特异性引物中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(c)中，逆转录引物中添加碱基修饰；优选地，所述碱基修饰包括3’LNA、3’C6 Spacer、3’Spacer 18中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(d)中，合成第二链cDNA的体系中还包含二链随机引物和DNA聚合酶，用带有通用序列的二链随机引物延伸第二链cDNA；
优选地，所述DNA聚合酶为klenow DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(e)中，PCR扩增体系中，采用的扩增引物包括引物组：P5 FR引物和P7 RF引物；其中，P5FR引物的序列包括磁珠上的一段通用引物序列；P7 RF的序列包括逆转录引物的通用引物序列。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述体液包括血液、唾液、尿液、母乳、脑脊液、羊水、腹水、胆汁以及胸腔积液中的一种或多种。
8.权利要求1～7中任一项所述的构建方法获得的细胞外RNA检测文库。
9.一种生物体液中细胞外RNA的检测方法，其特征在于，将权利要求1～7中任一项所述的构建方法获得的检测文库用于高通量测序，获得细胞外RNA检测结果。
10.一种如权利要求1～7中任一项所述的细胞外RNA文库的构建方法或如权利要求8所述的细胞外RNA检测文库在细胞外RNA高通量测序中的应用。
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