[发明专利]一种细胞外RNA文库的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种细胞外RNA文库的构建方法及其应用，涉及高通量测序以及文库构建技术领域。本发明的细胞外RNA文库的构建方法包括：(a)裂解体液样本；(b)加入含有标签序列的磁珠捕获样本中的RNA；(c)逆转录；(d)以第一链cDNA为模板，合成第二链cDNA；(e)获得的第二链cDNA经去核糖体RNA后PCR富集获得全转录组检测文库。该方法专门针对细胞外RNA的检测，不需要提取RNA，不需要通过特异性磁珠捕获mRNA的3’端的PolyA尾巴，直接裂解生物体液后用带barcode磁珠捕获RNA，实现高效、快速获得多种类型的文库，尤其在样本稀缺的情况下，有效实现样本的多种体液中的细胞外RNA测序。

技术领域

本发明涉及高通量测序以及文库构建技术领域，尤其是涉及一种细胞外RNA文库的构建方法及其应用。

背景技术

细胞外RNA(extracellular RNA，exRNA)最早在血浆和血清中被发现，由于细胞外间隙以及体液中存在RNA酶，exRNA的发现并没有引起科学界的关注，当时人们普遍认为exRNA无法稳定存在。直到2006年和2007年，两项开创性的工作分别证明RNA存在于微囊泡(microvesicles)和外泌体(exosomes)中，这些RNA可以被分泌到细胞外，作为信号分子影响受体细胞的行为。这个过程既可以发生在邻近的细胞之间，又能进行长距离的调控。这两项工作揭开了exRNA研究的序幕，也为探索细胞间的信号转导开辟了新的视角。随后，exRNA被发现存在于几乎所有的生物体液(body fluids)中，包括血液、唾液、尿液、母乳、脑脊液、羊水、腹水、胆汁以及胸腔积液中。高通量测序的结果也表明，除了mRNA以外，exRNA还包含多种非编码的RNA类型，如miRNA、piRNA、tsRNA、lncRNA、核仁小RNA等等。exRNA的广谱存在以及多样性提示我们，其很可能参与了重要的生物学过程，调控正常的生长发育以及癌症和疾病的发生，exRNA对于人类的健康或有着重大的意义和影响。

经典cDNA文库构建通常先提取总RNA，然后通过去除总RNA的rRNA，或者是用Oligo(dT)捕获poly(A)+RNA，加入随机引物逆转录，cDNA产物然后转化为合适长度的双链DNA，链接到平台特异的测序接头。最广泛使用的技术是使用RNA片段、Oligo dT随机引物(randomhexamer引物)，在合成第二链的时候添加dUTP；在加接头之后，含尿嘧啶的第二链会在PCR的过程中通过高保真度的DNA聚合酶被去除，或者被酶促降解，以达到链特异性。

具体来说，现有技术有着以下的局限性：1)需要先提取出总RNA(total RNA)；2)需要的模板量较多，一般总RNA都在1μg以上；3)需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种专门针对细胞外RNA的建库和检测方法及其应用，不需要提取RNA，直接裂解生物体液后用带barcode磁珠捕获RNA，实现高效、快速获得多种类型的文库，尤其在样本稀缺的情况下，有效实现样本的多种体液中的细胞外RNA测序。

本发明提供的技术方案如下：

一种细胞外RNA文库的构建方法，包括以下步骤：

(a)裂解体液样本；

(b)加入含有标签序列的磁珠捕获所述体液样本中的RNA；

(c)逆转录；

(d)以第一链cDNA为模板，合成第二链cDNA；

(e)获得的第二链cDNA经去核糖体RNA后进行PCR富集获得全转录组检测文库。