[发明专利]一种纯化TPO的工艺及方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种纯化TPO的工艺及方法，利用本发明公开的工艺及方法，纯化TPO蛋白不需要添加标签，大大的简化了纯化的步骤，且高浓度金属离子盐洗脱液TPO，得到的TPO蛋白稳定性好，不会在保存液中沉淀，利于后续试剂盒的开发应用。本发明还添加了筛选纯化TPO抗体的步骤，使Ni柱纯化工艺稳定，纯化出的TPO蛋白纯度高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种纯化TPO的工艺及方法。

背景技术

甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3kb，跨膜区的存在使TPO在表达时难以分泌出来，具有催化活性的部分伸向充满胶质滤泡腔的内部。TPO作为甲状腺激素在生物机体内合成过程中的一种重要酶，能参与催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的偶联过程，最终生成甲状腺素(T3、T4)。TPO同时也是甲状腺微粒体的主要抗原组成成分，当生物体甲状腺发生病变，导致滤泡细胞的生物结构受到破坏时，TPO随即经过甲状腺滤泡细胞腔的边缘部分即甲状腺细胞顶部的部位向外周血进行遗漏，从而刺激机体进行免疫系统调节，免疫系统随即产生TPO抗体(Anti-TPO)以应对刺激。

甲状腺过氧化物酶抗体(Anti-TPO)常见于患有自身免疫性甲状腺疾病的人群中，是一种甲状腺自身抗体，Anti-TPO阳性主要见于桥本甲状腺炎、原发性甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进患者等，在甲状腺功能检测中检测甲状腺过氧化物酶抗体(Anti-TPO)，已成为甲状腺功能基本的检测指标之一。

因此，为了高特异性的检测Anti-TPO，开发出高表达、高纯度的TPO对于临床检测和实验研究都尤为重要，但目前国内表达的TPO普遍纯度不高，纯化后的蛋白性能不佳，容易发生沉淀，且TPO蛋白应用到下游试剂线中存在回收率较低的问题，极大的限制了TPO检测的发展。

发明内容

本发明在纯化TPO时，发现TPO纯化的纯度不高，主要是因为目前市售的Ni柱纯化工艺不稳定，纯度较低，而TPO使用抗体纯化必定跨过等电点，致使过程沉淀严重影响纯化得率。因此必须找到一种洗脱方式避免跨过等电点，满足需求并不影响TPO性能。

为了解决纯化后蛋白容易沉淀的问题，本发明提供了一种纯化TPO的工艺，包括，

(1)筛选纯化TPO抗体；

(2)将步骤(1)中纯化后的TPO抗体与填料按一定条件混合，制成亲和层析柱；

(3)将需要纯化的样本加入步骤(2)制备的亲和层析柱中，利用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，纯化TPO蛋白；

优选的，所述步骤(3)中的洗脱液，包含1-5M的金属离子盐，pH＝6.5-8.0。

优选的，所述TPO抗体与填料按一定条件混合为TPO抗体：填料＝10：1混合。

优选的，所述金属离子盐的浓度为2-4M，pH＝6.8-7.3。

优选的，所述金属离子盐选自NaCl、LiCl或MgCl₂，更优选的，所述金属离子盐选自MgCl₂。

抗体纯化通常采用pH＝2.7的甘氨酸进行洗脱，但将抗体原料应用到免疫反应中，需要中性偏碱性的缓冲环境，TPO的等电点为6.13，当将洗脱下来的pH＝2.7抗体溶液pH调节到中性或碱性，会经过TPO的等电点，导致TPO的沉淀，纯化出的TPO稳定性差，影响后续应用，本发明的洗脱液中添加金属离子盐，且将pH控制在偏中性的条件下，解决了纯化后TPO蛋白的稳定性问题，不会存在沉淀的现象。

另一方面，为了解决TPO纯化的纯度不高的问题，本发明提供了一种生产高纯度TPO的方法，包括，

(1)重组TPO基因转入细菌细胞制备质粒；