[发明专利]一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法

权利要求书

1.一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品处理：血清或者血浆离心5000g，20min，取上清；

2)超滤：将上清用0.45um滤膜过滤，收集过滤后的液体；

3)亲和层析：用同时含由CD9\CD63\CD81三种抗体的亲和层析介质进行亲和层析；

4)收集外泌体；

5)进行各项检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，其特征在于，步骤5)中的各项检测包括NTA检测、外泌体样品透射电镜检测以及Wb检测。

3.根据权利要求2所述的一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，其特征在于，所述NTA检测包括以下步骤：

(1)使用纯水通过注射器打入样本池进行样本池清洗3次；

(2)清洗干净后，将PBS重悬的外泌体稀释到合适浓度通过针筒打入样本池中，然后把整个样本池推入zetaview主机内；

(3)通过计算机显示屏观察外泌体颗粒实时动态影像。

4.根据权利要求2所述的一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，其特征在于，所述外泌体样品透射电镜检测包括以下步骤：

(1)将外泌体取出10μL；

(2)吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；

(3)醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；

(4)常温干燥数分钟；

(5)100kv进行电镜检测成像；

(6)获得透射电镜成像结果。

5.根据权利要求2所述的一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，其特征在于，所述Wb检测包括以下步骤：

(1)蛋白提取；

(2)蛋白浓度定量：使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；

(3)SDS-PAGE电泳：

1、样品处理：

①根据样品浓度确定上样量，保证每个样品总蛋白上样量均为50μg；

②在蛋白样品中加入适当量的5×蛋白上样缓冲液，95-100℃沸水浴5min；

2、制胶与上样：

①配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶，在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面，约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；

②配制浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中；

③拔出梳子，将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将样品加入点样孔中；

④按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿；

3、转膜：

①准备转膜滤纸和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化，活化时间3min；

②按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡；

③按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整；

4、抗体孵育：

①将转好的膜加入封闭液室温封闭1h；

②除去封闭液，加入用一抗稀释液稀释好的一抗4℃过夜(一抗浓度范围0.5-2ug/ml)；

③回收已稀释的一抗，用TBST洗三次，每次5min；

④加入二抗稀释液稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四次，每次5min(二抗稀释比1：10000)；

5、化学发光检测：

①滴加新鲜配制的ECL混合溶液，A:B＝1:1，到膜的蛋白面侧，暗室中曝光；

②根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。