[发明专利]一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法

说明书

本发明涉及外泌体提取技术领域，且公开了一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，包括以下步骤：1)样品处理：血清或者血浆离心5000g，20min，取上清；2)超滤：将上清用0.45um滤膜过滤，收集过滤后的液体；3)亲和层析：用同时含由CD9\CD63\CD81三种抗体的亲和层析介质进行亲和层析；4)收集外泌体；5)进行各项检测，各项检测包括NTA检测、外泌体样品透射电镜检测以及Wb检测。该基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，采用联合超滤和亲和层析法结合，相对于亲和层析法，将得率从8.9E+8Particles/mL提升到1.2E+10Particles/mL，相对于超滤法，NTA检测结果由杂峰变为单峰，能明显提升外泌体的得率以及纯度，可以更好的应用于下游的NTA、电镜以及wb检测。

技术领域

本发明涉及外泌体提取技术领域，具体为一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法。

背景技术

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡，1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究，外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

目前分离血清血浆中外泌体方法主要有超速离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、亲和层析法以及微流控芯片法，但是各种方法都有其缺点，其中，超速离心法依赖贵重设备高速离心机，成本较高，超滤法以及尺寸排阻色谱法纯度不够，亲和层析法得率较低，而微流控芯片法目前技术还不成熟，针对以上缺点，故而提出一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法以解决上述问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，该基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法采用联合超滤和亲和层析法结合，相对于亲和层析法，将得率从8.9E+8Particles/mL提升到1.2E+10Particles/mL，相对于超滤法，NTA检测结果由杂峰变为单峰，能明显提升外泌体的得率以及纯度，可以更好的应用于下游的NTA、电镜以及wb检测。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法，包括以下步骤：

1)样品处理：血清或者血浆离心5000g，20min，取上清；

2)超滤：将上清用0.45um滤膜过滤，收集过滤后的液体；

3)亲和层析：用同时含由CD9\CD63\CD81三种抗体的亲和层析介质进行亲和层析；

4)收集外泌体；

5)进行各项检测。

优选的，步骤5)中的各项检测包括NTA检测、外泌体样品透射电镜检测以及Wb检测。

优选的，所述NTA检测包括以下步骤：

(1)使用纯水通过注射器打入样本池进行样本池清洗3次；

(2)清洗干净后，将PBS重悬的外泌体稀释到合适浓度通过针筒打入样本池中，然后把整个样本池推入zetaview主机内；