[发明专利]基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法

说明书

本发明涉及一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，包括将抗原稀释至预设浓度后分组静置，洗涤后备用；将HRP标记蛋白分组并分别稀释至不同浓度；将HRP标记蛋白滴入至抗原内，孵育后加入底物液，依次检测各组标定混合物的亮度，根据HRP标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线以确定HRP抗体的工作浓度。本发明通过实时监测各组HRP标记蛋白与抗原之间的反应情况从而精准确定各组标定混合物在反应过程中释放的实际亮度值并得到精准的浓度‑亮度对应关系，在绘制亮度‑浓度曲线时，能够使曲线更加符合HRP标记蛋白的实际浓度‑亮度对应关系，从而有效提高了本发明所述方法针对HRP标记蛋白的工作浓度的检测精度。

技术领域

本发明涉及标记蛋白工作浓度检测技术领域，尤其涉及一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法。

背景技术

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，其名称的由来是因为在辣根中该酶的含量很高，它是目前使用最广泛的一种标记酶，用来标记抗体或其它蛋白质，既能用于定位检测，也能于定量测定。辣根过氧化物酶结构稳定且催化性能特殊，可以在宽泛的条件下对氧化吩类及苯胺类芳香族化合物的氧化反应均有良好的催化功能。而且它的反应温和、活性高、选择性高且无污染，常用于医学诊断生化检测等各个领域。而石墨烯量子点是一种准零维的纳米材料，尺寸可以在几个纳米以下，具有一层、两层或者几层的石墨烯结构，石墨烯量子点表现出生物低毒性、优异的水溶性、化学惰性、稳定的光致发光、良好的表面修饰，在生物、化学、药理等领域有着广泛的应用，本文建立利用石墨烯量子点作为荧光探针构建辣根过氧化物酶检测的新方法。

在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

然而，在现有技术中，无法针对用作标记蛋白的HRP的工作浓度进行快速精准的测量，从而导致在使用HRP标记蛋白进行标记时易出现偏差，无法对标记物进行精准测量，导致HRP标记蛋白针对标记物的测量精度低。

发明内容

为此，本发明提供一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，用以克服现有技术中无法针对HRP标记蛋白的工作浓度进行精准检测的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，包括：

步骤a，使用包被缓冲液将抗原稀释至预设浓度后将稀释后抗原分成多组，将各组抗原分别物理吸附于不同的固相载体并在预设静置温度环境下将各组抗原静置预设时长；

步骤b，使用洗涤缓冲液依次洗涤所述步骤a中静置预设时长的多组抗原并在洗涤完成后备用；

步骤c，将HRP标记蛋白分成多组，使用BSA-PBS溶液依次对各组HRP标记蛋白进行稀释以制备多组不同浓度的HRP标记蛋白；

步骤d，依次将所述步骤c中制备的不同浓度的HRP标记蛋白滴入至对应组的所述抗原内以形成标定混合物，将固相载体加热至预设孵育温度以对标定混合物进行孵育并在标定混合物的孵育时长达到预设值时向各组标定混合物所在固相载体内加入底物液，加入完成后实时监测各组固相载体中标定混合物的反应情况，当判定标定混合物反应完成时，使用比色仪依次检测不同组标定混合物的亮度值，根据标定混合物中的HRP标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线图并根据曲线图确定HRP标记蛋白的工作浓度；

在针对第i组所述标定混合物的反映情况进行监测时，设定i=1，2，3，...n，建立预设反映情况矩阵Qi，设定Qi（Si，fi，Ni，tmaxi），其中，Si为第i组标记蛋白的稀释浓度，fi为针对第i组标定混合物亮度的检测周期，Ni为针对第i组标定混合物亮度的预设判定周期数量，tmaxi为针对第i组标定混合物的最大监测时长；