[发明专利]一种快速、定量分析微生物细胞工厂发酵代谢产物的方法有效
申请号: | 202111601848.6 | 申请日: | 2021-12-24 |
公开(公告)号: | CN114280189B | 公开(公告)日: | 2022-09-09 |
发明(设计)人: | 康巍;马骁;薛闯;吴又多;万慧慧;吴芷玥;郑丹妮 | 申请(专利权)人: | 大连理工大学;大连理工大学宁波研究院 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72 |
代理公司: | 大连东方专利代理有限责任公司 21212 | 代理人: | 周媛媛;李馨 |
地址: | 116024 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 定量分析 微生物 细胞 工厂 发酵 代谢 产物 方法 | ||
1.一种快速、定量分析微生物细胞工厂发酵代谢产物的方法,其特征在于,主要包括以下步骤:
(1)将重组微生物发酵液离心,收集菌体;
(2)将步骤(1)收集的菌体采用淬灭试剂进行淬灭;
(3)制备提取溶剂:乙醇:乙腈:水=1-3:1-3:1,v/v,添加体积比为0.5~5%的2,6-二叔丁基对甲酚;
(4)离心收集步骤(2)中淬灭后的菌体,并加入步骤(3)制备的提取溶剂涡旋提取5~30min;
(5)利用液氮对步骤(4)的提取混合液进行冻融并涡旋提取,重复2次以上;
(6)将步骤(5)所得的样品离心,取上清,冷冻干燥,获得冻干样品;
(7)将冻干样品溶于乙腈水溶液中,过0.22μm滤膜,获得待测样品;
(8)通过LC-MS对待测样品中多种化合物进行检测,条件如下:
①色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column,1.7μm,2.1mm×150mm,1/pkg;流动相为:A:10mM乙酸铵的20%乙腈水溶液,B:10mM乙酸铵的80%乙腈水溶液;流速0.300ml/min;梯度洗脱:0-2min:100%B,2-3min:100%-65%B,3-9min:65%B,9-10min:65%-100%B,10-16min:100%B;
②质谱条件:电喷雾离子源;负离子扫描;扫描模式:FullMS/dd-MS2,FullMS分辨率70000FWHM,dd-MS2分辨率17500FWHM,扫描范围:150.0~1200.0m/z;鞘气温度:350℃;鞘气流速:45;辅助气流速:10;吹扫气流速:0;喷射电压:3.50kV;传输管道温度320℃;辅助气加热器温度350℃;
步骤(1)中所述的重组微生物包括重组大肠杆菌;
步骤(2)中所述的淬灭试剂包括甲醇,乙腈,甲醇-乙腈-水混合溶液,二甲亚砜,4%多聚甲醛溶液;
所述的方法对重组微生物中CoA、Ac-CoA、AcAc-CoA、HMG-CoA、MVA、MVA-5P、IPP、GPP、FPP、GGPP共十种化合物进行定量分析;
所述的重组微生物异源表达乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A还原酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、异戊二烯二磷酸合成酶基因、八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素去饱和酶基因。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)、步骤(4)和步骤(6)中的离心条件为5000~15000×g离心5~30min。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,淬灭试剂的用量为步骤(1)中的重组微生物发酵液体积的0.1-5倍。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述提取溶剂为乙醇:乙腈:水=2:2:1,v/v,添加体积比为1%的2,6-二叔丁基对甲酚;步骤(4)中所述的提取溶剂的用量为步骤(1)中的重组微生物发酵液体积的0.05-1倍。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)中所述的冻融并涡旋提取的具体过程为利用液氮冷冻后于冰上融解4min,并漩涡提取30s。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(7)中所述乙腈水溶液组成为乙腈:水=1:1,v/v。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法采用外标法进行检测。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的重组微生物发酵培养液的OD600达到0.4-1时添加IPTG。
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