[发明专利]一种快速、定量分析微生物细胞工厂发酵代谢产物的方法

说明书

本发明公开了一种快速、定量分析微生物细胞工厂发酵代谢产物的方法，属于生物技术领域。本发明在大肠杆菌宿主中构建甲羟戊酸途径与番茄红素合成途径，获得能够生物合成番茄红素的大肠杆菌，发酵后，离心收集菌体、淬灭处理，提取获得待检样品，通过LC‑MS进行定性定量分析。本发明的优点在于仅通过一种方法就可以对样品中的CoA、Ac‑CoA、AcAc‑CoA、HMG‑CoA、MVA、MVA‑5P、IPP、GPP、FPP、GGPP共十种化合物进行定性定量分析，提供了一种精密度高，灵敏度好的高效检测方法，大大简化了以往的检测方法，降低检测成本，有利于从复杂的基质中提取并定量检测多种目标化合物。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速、定量分析微生物细胞工厂发酵代谢产物的方法。

背景技术

萜类化合物(terpenoids)是分子骨架以异戊二烯五碳单元为基本结构的化合物及其衍生物，是植物次生代谢产物中最大的一个家族。萜类化合物广泛存在于自然界，是构成一些植物香精、树脂、色素、部分动物激素以及维生素等的主要成分。多种萜类化合物具有重要的生理活性与极高的经济价值，如虾青素、青蒿素、紫杉醇、大麻素等等，这些萜类化合物已被广泛应用于食品添加剂、保健品、化妆品、以及抗肿瘤药物等。

由于萜类化合物结构复杂、稳定性差，其化学合成步骤繁琐、得率低，且易造成环境污染。因此，目前萜类物质的主要生产方式为天然产物提取。但天然植物来源的萜类物质积累缓慢，提取困难，耗时长。而利用微生物细胞工厂生物合成萜类化合物，不仅环境友好、节省耕地，而且具有良好的酶选择性与可调控性，生产效率高，成本低，具有广阔的发展前景。

萜类化合物高效生物合成的关键在于前体物质的充足供应，萜类分子的五碳单元异戊烯基焦磷酸(IPP)可以通过两种途径独立合成，即甲羟戊酸(mevalonate，MVA)途径和甲基赤藓醇-4-磷酸(methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP)途径。随后，IPP进一步转化为十碳单元牻牛儿基焦磷酸(GPP)、十五碳单元法尼基焦磷酸(FPP)、二十碳单元牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，并通过骨架单元的氧化、酮基化、环化等一系列修饰，最终合成单萜、二萜、倍半萜等多种萜类化合物。

综上，萜类化合物的生物合成过程总计包含10种中间代谢化合物，定量分析这些中间代谢产物是检测萜类物质合成代谢流的重要手段，可以为下一步的精确调控提供有效的指导和依据，对于深入研究萜类化合物的生物合成、进一步提高萜类化合物生物合成效率十分重要。但是上述中间代谢产物的分析仍然面临许多挑战。首先，由于萜类化合物前体合成过程中中间代谢物众多、性质各异，因此所采用的提取方法、色谱柱以及色谱条件存在很大差异；其次，上述中间代谢产物多含有焦磷酸基团，因而稳定性差，提取困难。因此，同时检测萜类化合物合成途径中各种中间代谢产物耗时长、成本高。

针对上述问题，专利CN104297380A公开了一种基于LC-MS/MS检测萜类化合物合成前体的方法。该方法采用提取溶剂(甲醇/氨水＝70/30，v/v)低温超声萃取，LC-MS/MS可检出IPP、GPP、FPP、GGPP化合物。然而，该方法仅可检出萜类合成10种物质中的4种前体化合物，因而无法利用该方法整体分析萜类合成的代谢流。另外，该方法中单纯的低温超声萃取方法，难以防止破碎过程中细胞内容物对目标化合物的氧化分解，提取效率低。于此同时，该方法仅适用于新鲜的烟草叶，并非针对主要的细胞工厂。Wei Kang等人建立了基于三种色谱柱的检测方法。采用Luna 3μm NH2 column(150×2mm²,3μm)、ACE Ultra Core 2.5Super C18 column(100×2.1mm²,2.5μm)、Thermo Fisher hypercarb column(100×2.1mm²,3μm)三根色谱柱，与三种不同的色谱条件成功检出萜类化合物合成中的10种前体代谢产物。但是该方法需要三根不同的色谱柱，且每根色谱柱溶剂不同，因而成本极高；另外，采用三种不同的色谱方法，耗时长、检测设备占用率高；于此同时，三种不同的检测方法极易造成组件误差，影响实验结果。