[发明专利]基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法

权利要求书

1.基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)利用Illumina转录组文库构建试剂盒分别构建长江刀鲚雌、雄群体脑组织的转录组cDNA测序文库，进行高通量转录组测序，测序数据经Trinity软件分别进行组装和去冗余后，获得长江刀鲚雌性转录组Unigenes数据，以下简称CEF.fa，和雄性转录组Unigenes数据，以下简称CEM.fa；

B)在Linux操作系统下利用MISA软件分别扫描和检索CEF.fa和CEM.fa中的EST-SSRs，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别设置10、6、6、5、5和5；复合SSR两个位点间最大间隔碱基数设置为100；

C)在Linux操作系统下利用SSRMMD软件检索CEF.fa和CEM.fa中完美的EST-SSR位点和候选的多态性EST-SSRs，其中软件运行参数如下所示：perl SSRMMD.pl-f1 CEFM/CEF.fa-f2 CEFM/CEM.fa-p 1-me NW-st 0-t 2；

D)从筛选出来的多态性EST-SSRs中随机选取20条序列，结合长江刀鲚参考基因组序列特征和EST-SSRs两侧保守的侧翼序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性PCR扩增引物，进行标记有效性和多态性检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有效性和多态性检测，包括以下步骤：

a)取自不同年份长江刀鲚养殖群体的鳍条组织中，随机选取10个样本，每个样本剪取30mg左右鳍条组织，然后提取不同养殖长江刀鲚个体的基因组DNA；

b)将随机选取的10个养殖刀鲚的DNA样本，等量混合后，作为后续PCR扩增的模板，在Eppendorf MastercyclerX50s梯度PCR仪器上筛选各引物的最适退火温度；

c)PCR反应体系为10μl，其中包括：长江刀鲚模板DNA 1μl，10μM正、反引物各0.25μl，2×Taq PCR MasterMix 5μl，然后用ddH₂O补足总体积至10μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸10min，4℃∞保存；

d)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶成像系统拍照、保存，确定各引物的最适退火温度和有效性；

e)获得各引物的最适退火温度后，分别从前期保存的2018年、2019年和2020年繁育的刀鲚样本中各随机选取24尾，共计72个样本，每个样本剪取30mg左右鳍条组织，然后分别提取DNA；

f)EST-SSRs多态性的初步验证：以72个样本DNA为模板，按照之前的PCR扩增体系和反应程序获得PCR产物，PCR产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，利用银染法显色定影，条带显色清晰后用数码相机拍照保存，用于后续的多态性分析；

g)数据处理：利用GenAlEx 6.0软件计算长江刀鲚不同年份养殖群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)及期望杂合度(He)等遗传多样性参数；利用PIC-Calc 0.6软件计算多态信息含量；利用MEGA 6.0软件计算不同群体间的UPGMA聚类分析树。

3.一种采用如权利要求1或2所述的方法获得的长江刀鲚多态性EST-SSR引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36所示。

4.一种如权利要求3所述的引物在长江刀鲚群体遗传分析、分子标记辅助育种中的应用。