[发明专利]基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法

说明书

本发明涉及养殖长江刀鲚分子标记开发技术领域，具体是基于转录组的长江刀鲚多态性EST‑SSRs的快速识别方法。本发明基于养殖长江刀鲚雌、雄个体的脑转录组数据，从5675条养殖长江刀鲚雌雄转录组共有EST‑SSR序列中筛查到1082个多态性EST‑SSRs(19.07％)，并随机选取20个位点设计特异性PCR扩增引物进行有效性和多态性验证，结果显示，有19对能够扩增出稳定、清晰的条带，其中18对具有多态性(多态率约90％)，检出效率较高且能够有效地评估长江刀鲚不同年份养殖群体的种质资源现状。

技术领域

本发明涉及养殖长江刀鲚分子标记开发技术领域，具体地说，是基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法。

背景技术

刀鲚(Coilia ectenes)，俗称刀鱼、毛刀鱼，在分类学上隶属于鲱形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鲚属(Coilia)，在我国各大水系均能发现其踪迹，其中以长江流域最负盛名，因其鱼体丰腴肥满，肉质细嫩鲜美，曾与鲥鱼、河豚并称为“长江三鲜”，深受消费者的青睐。历史上，我国刀鲚的种质资源极为丰富，然而，近年来，由于酷捕滥渔，水域环境的污染、水文条件的改变、生态环境的恶化及海岸工程建设等诸多因素，其自然种质资源急剧衰退，每年的产量波动很大，且呈现出逐年降低且个体日趋小型化的趋势，甚至不能形成优势种群，其自然种质资源岌岌可危。所幸的是，农业农村部通告要求自2019年2月1日起，将停止发放刀鲚(长江刀鱼)专项捕捞许可证，禁止其天然资源的生产性捕捞；次年又开始实施长江“十年禁渔”的政策；而刀鲚全人工繁育技术和苗种规模化生产技术亦获得了突破性进展，这些举措不仅促进了刀鲚产业化养殖的发展，而且有效地缓解了长江刀鲚野生种质资源锐减的局面。

基于长江刀鲚“十年禁捕”和良种匮乏的现状，开展长江刀鲚良种培育的研究势在必行。而开展刀鲚的遗传改良研究，不仅需要掌握其优良的表型性状，而且需要充分了解其繁育亲本的遗传背景，以保证繁育亲本具有优良生长性状的同时，又能保持丰富的遗传变异，并降低近交衰退发生的机率，促进良种的培育效果，因此开展刀鲚繁育亲本的种质资源评估显得尤为重要。

分子标记由于能够对动物整个基因组的遗传变异进行探究，且相对稳定，不易受到环境的影响而被广泛应用于水产动物的遗传育种研究，其中，微卫星标记(Microsatellite)备受关注。微卫星标记，又称为简单重复序列(Simple SequenceRepeats，SSR)，是指由1-6个核苷酸组成的简单串联重复序列，这些重复序列在重复单位和重复次数上的差异使其具有高度变异性和多态性，被广泛应用于水产动物种质资源评估和鉴定、遗传图谱的构建、QTL定位及分子标记辅助育种等遗传学研究，为水产动物遗传育种工作的开展提供极大的便利。一般而言，基于SSR来源差异，可分为基因组SSR(GenomicSSR，G-SSR)和表达序列标签SSR(Expressed Sequence Tag，EST-SSR)两种类型，前者主要利用磁珠富集法或FIASCO法富集微卫星、构建和筛选基因组文库等方法从基因组序列开发而来，多态性相对较高；后者则主要基于cDNA文库或转录组数据获得的转录序列开发获得，往往与功能基因直接相关，虽然多态性相对g-SSR低，但是保守性和通用性较高。海量的高通量测序数据为水产动物微卫星标记的开发提供了便利条件，同时一大批针对于高通量转录组数据挖掘EST-SSRs的软件(MIcroSAtellite identification tool，MISA)及多态性位点筛选的软件(Simple Sequence Repeat Molecular Marker Developer，SSRMMD)陆续被开发出来，极大的加快了用于水产动物种质资源评估分子标记的开发进程。

但是关于基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法目前还未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法，以解决现有长江刀鲚多态性分子标记匮乏的现状。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：