[发明专利]一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：包括检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物和探针；

所述检测A1762T突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:1-3所示；检测G1764A突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:4-6所示；

检测A1762T突变位点的上游引物自5'端第21位设置1个碱基错配，错配方式为A-T互换；检测G1764A突变位点的下游引物自5'端第20位和第22位分别设置1个碱基错配，错配方式分别为A-C互换，G-T互换。

2.如权利要求1所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：检测A1762T和G1764A突变位点的上下游引物自5'端第15-20位的一个碱基或多个碱基均加入锁核酸修饰。

3.如权利要求1所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括HBV野生型引物和探针，引物和探针序列如SEQ ID NO:7-9所示。

4.如权利要求3所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测A1762T和G1764A两个突变位点的探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1猝灭基团；所述HBV野生型探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。

5.如权利要求3所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：还设置有内参引物和探针，所述内参为根据人描定蛋白重复区域53所设计，所述内参引物和探针的序列如SEQ ID NO:10-12所示。

6.如权利要求5所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述内参探针的5'端标记VIC荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。

7.如权利要求5所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应混合液、阳性对照和阴性对照。

8.如权利要求7所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应混合液包括如SEQ ID NO:1-12所示的引物和探针，2×ddPCR SupermixforProbes；阳性对照为含有A1762T和G1764A双个突变位点的HBV DNA片段的质粒，阴性对照为阴性血清。

9.如权利要求8所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述如SEQ ID NO:1-12所示的引物和探针的浓度均为10μmol/L，如SEQ ID NO:1-2、4-5所示的引物用量均为1μL，如SEQ ID NO:3、6所示的探针用量均为0.8μL；如SEQ ID NO:7-8所示的引物用量均为0.9μL，如SEQ ID NO:9所示的探针用量为0.4μL；2×ddPCR Supermixfor Probes用量为10μL。

10.如权利要求1-9任一所述的一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1，提取样本DNA；

S2，配置数字PCR反应液：每个反应管加15μLPCR反应混合液和5μL样本；

S3，制备微滴，PCR扩增，扩增步骤：95℃变性10min；94℃退火15s；58℃延伸60s，退火-延伸共40个循环；98℃10min，4℃5min，结束反应；

S4，使用微滴读取仪进行微滴读取和分析。