[发明专利]一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提出了一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法，试剂盒包括检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物和探针、HBV野生型引物和探针、内参引物和探针、PCR反应混合液、阳性对照和阴性对照。检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物自5'端第15位和第20位碱基加入锁核酸修饰。检测A1762T突变位点的上游引物自5'端第21位设置1个碱基错配；检测G1764A突变位点的下游引物自5'端第20位和第22位分别设置1个碱基错配。本发明通过ARMS‑PCR引物设计技术和锁核酸技术，提高了突变检测的准确性，具有较高的灵敏度和特异性，同时与测序法相比操作更为简便。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

乙型肝炎(HBV)是严重威胁我国人民健康的病毒性传染病之一，在HBV持续感染过程中，其基因组DNA可出现各种变异，其变异率远远高于其它DNA病毒。核心启动子(BCP)区是HBV前C区mRNA转录的重要元件，BCP区的突变在病毒复制、表达及致病等方面有着重大意义。BCP区的突变形式包括T1753A/C、A1762T、G1764A等，其中以1762-1764双联突变最为常见。与野生株相比，BCP区变异株由于病毒复制水平提高，逃脱机体的免疫监视而具有更强的致病性，同时变异株对抗病毒药物产生耐药性，其结果一方面引起持续感染而不断诱导肝细胞炎性损害，降低肝脏功能贮备，并增加产生新的HBV基因突变的机会；另一方面突变病毒毒力的增强和抗原表位的改变，可以引起过度免疫应答反应，造成严重的肝细胞损伤，导致乙肝慢性化、重症化，甚至癌变。因此早期诊断BCP突变对于乙肝治疗和肝癌防治具有重大意义。

目前BCP区的突变的检测方法包括荧光PCR和测序法等。其中由于BCP区突变以点突变为主，虽然荧光PCR检测具有较高的灵敏度，但是其对单一核酸突变的区分性较差，不能很好的区分野生型和突变型，容易造成假阴性。测序法则具有准确性高，可区分具体突变型的优点，但是其操作极其繁琐，一次测序包含多次PCR、纯化等操作，耗时常在1天以上，且对实验人员的技术要求较高，本发明旨在开发一种用于BCP区突变检测的数字PCR技术，通过ARMS-PCR引物设计技术和锁核酸技术，提高突变检测的准确性，同时与测序法相比操作更为简便。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了可用于检测血清或血浆中的HBV病毒BCP区1762/1764突变，且具有较高的灵敏度和特异性的一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，包括检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物和探针；

所述检测A1762T突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:1-3所示；检测G1764A突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:4-6所示；

检测A1762T突变位点的上游引物自5'端第21位设置1个碱基错配，错配方式为A-T互换；检测G1764A突变位点的下游引物自5'端第20位和第22位分别设置1个碱基错配，错配方式分别为A-C互换，G-T互换。

在以上技术方案的基础上，优选的，检测A1762T和G1764A突变位点的上下游引物自5'端第15-20位的一个碱基或多个碱基均加入锁核酸修饰。

在以上技术方案的基础上，优选的，还包括HBV野生型引物和探针，引物和探针序列如SEQ ID NO:7-9所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测A1762T和G1764A两个突变位点的探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1猝灭基团；所述HBV野生型探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。