[发明专利]一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法

权利要求书

1.一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、以大肠杆菌BL21基因组为模板，经扩增、基因片段重叠延伸PCR、扩增产物纯化后转化到大肠杆菌基因BL21感受态细胞中，得到△ispB菌株EC1；

步骤二、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，PCR扩增得到hepT基因片段，将PCR产物连接载体pET-28得到重组质粒pET-hepT，之后转化至EC1中，得到菌株EC2；

步骤三、根据待突变LsrR的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以构建的重组质粒pET-lsrR为模板，通过PCR扩增出产物，经转化处理得到突变的重组质粒转入EC2，得到菌株EC3；

步骤四、根据待突变lsrK的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以构建的重组质粒pET-lsrK为模板，通过PCR扩增出产物，经转化处理得到突变的重组质粒转入EC3，得到用于高效合成MK-7的菌株EC4。

2.根据权利要求1所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，所述步骤一中扩增是采用如SEQ ID NO.1-6所示的引物组PCR扩增得到左、右同源臂和中间片段。

3.根据权利要求2所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，三个基因片段重叠延伸PCR的条件为：98℃预变性5min；然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸32s，总共34个循环。

4.根据权利要求1所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增是采用如SEQ ID NO.7-8所示的引物对进行扩增。

5.根据权利要求1所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，所述重组质粒pET-lsrR的构建方法包括如下步骤：

A1、将大肠杆菌BL21培养至指数生长中期，提取全基因组DNA；

A2、设计如SEQ ID NO.9-10所示的引物对以进行PCR扩增；

A3、扩增产物纯化后，用XbaI和BglII对PCR产物和载体pET-28a进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pET-lsrR。

6.根据权利要求5所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，所述待突变LsrR的氨基酸位点为LsrR的第123位天冬酰胺，设计PCR点突变引物对如SEQ IDNO.11-12所示，以将第123位天冬酰胺突变为赖氨酸，扩增产物转化处理得到重组质粒pET-lsrR’转入菌株EC2，得到待表达的突变株EC2^N123K，即菌株EC3。

7.根据权利要求6所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，所述重组质粒pET-lsrK的构建方法包括如下步骤：

A1、将大肠杆菌BL21培养至指数生长中期，提取全基因组DNA；

A2、设计如SEQ ID NO.13-14所示的引物对以进行PCR扩增；

A3、扩增产物纯化后，用XbaI和BglII对PCR产物和载体pET-28a进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pET-lsrK。

8.根据权利要求7所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，其特征在于，所述待突变LsrK的氨基酸位点为LsrK的第325位谷氨酰胺，设计PCR点突变引物对如SEQ IDNO.15-16所示，以将第325位谷氨酰胺突变为组氨酸，扩增产物转化处理得到重组质粒pET-lsrK’转入菌株EC2，得到待表达的突变株EC3^Q325H，即菌株EC4。