[发明专利]一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法

说明书

本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法，包括如下步骤：步骤一、以大肠杆菌BL21基因组为模板，构建得到△ispB菌株EC1；步骤二、以枯草芽孢杆菌168全基因组为模板，扩增得到hepT基因，通过与pET‑28a载体连接构建得到菌株EC2；步骤三、根据待突变LsrR的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以构建的重组质粒pET‑lsrR为模板，构建得到菌株EC3；步骤四、根据待突变lsrK的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，构建得到用于高效合成MK‑7的菌株EC4。本发明通过调控大肠杆菌菌膜形态，促进大肠杆菌维生素Ksubgt;2/subgt;的MK‑7高效合成。

技术领域

本发明及遗传工程技术领域，尤其涉及一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法。

背景技术

作为一类重要的脂溶性维生素，维生素K₂在食品和医药领域都有着重要应用。健康人群适量补充富含维生素K₂食品，可有效减小骨折发病率。另外，越来越多的资料显示维生素K缺乏是引发世界性婴儿出血疾病和死亡的重要原因。并且，同辅酶Q相似，维生素K₂作为一种膜结合电子载体，具有修复损伤细胞线粒体的功能，这对于人类免受帕金森症和新冠愈后肺纤维化折磨起着重要的作用。由于这几方面的应用，国际市场对维生素K₂的需求近年来不断增加。

维生素K₂的化学结构由一个甲基萘醌主链和n个异戊二烯侧链连接而成。根据侧链上异戊二烯的个数，通常以MK-n表示，n通常为4-13。其中，MK-7与其它同系物相比，对人体具有更好的亲和性和更长的半衰期。MK-7通常为纳豆芽孢杆菌代谢产生，由于纳豆芽孢杆菌难以接受外来基因，其基因操作难度较大，并且发酵生成MK-7的周期较长。而作为模式微生物的大肠杆菌，因具有遗传背景清晰，易于基因操作和生长迅速的特点，具有MK-7工业化生产的巨大潜力。然而，大肠杆菌自身只能合成MK-8，如何改变维生素K₂侧链在大肠杆菌中的代谢合成个数，以及如何实现MK-7在大肠杆菌中的高效合成，是值得深入探讨的问题。而通过调控大肠杆菌菌膜形态，促进大肠杆菌维生素K₂的合成方法，这在以往的报道中尚未见到。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，以通过调控大肠杆菌菌膜形态，解决大肠杆菌无法高效合成MK-7的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK-7的方法，包括如下步骤：

步骤一、以大肠杆菌BL21基因组为模板，经扩增、基因片段重叠延伸PCR、扩增产物纯化后转化到大肠杆菌基因BL21感受态细胞中，得到△ispB菌株EC1；

步骤二、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，PCR扩增得到hepT基因片段，将PCR产物连接载体pET-28得到重组质粒pET-hepT，之后转化至EC1中，得到菌株EC2；

步骤三、根据待突变LsrR的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以构建的重组质粒pET-lsrR为模板，通过PCR扩增出产物，经转化处理得到突变的重组质粒转入EC2，得到菌株EC3；

步骤四、根据待突变lsrK的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以构建的重组质粒pET-lsrK为模板，通过PCR扩增出产物，经转化处理得到突变的重组质粒转入EC3，得到用于高效合成MK-7的菌株EC4。

优选的，所述步骤一中扩增是采用如SEQ ID NO.1-6所示的引物组PCR扩增得到左、右同源臂和中间片段。中间片段为氯霉素抗性片段，其与左、右同源臂基因序列片段构成三个基因片段。

优选的，三个基因片段重叠延伸PCR的条件为：98℃预变性5min；然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸32s，总共34个循环。此种条件设置，能够更好的得到融合基因片段。