[发明专利]一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法及其工程菌和应用在审
| 申请号： | 202111614279.9 | 申请日： | 2021-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN114369612A | 公开（公告）日： | 2022-04-19 |
| 发明（设计）人： | 武刚;刘文庆;张丽;薛虎平;俞颖;胡海燕;陈玉玲;李萍;张甲戌 | 申请（专利权）人： | 甘肃奥林贝尔生物科技集团有限公司;甘肃奥林贝尔生物工程研究院有限公司;甘肃奥谱金肽生物工程技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N1/21;C12P21/02;C07K14/195;C12R1/01 |
| 代理公司： | 成都弘毅天承知识产权代理有限公司 51230 | 代理人： | 崔璐 |
| 地址： | 734000 甘肃省张掖*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高效 分泌 nisin 基因工程 构建 方法 及其 工程 应用 | ||
1.一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从质粒pUC57中PCR扩增获得nisAI基因，将其与线性化的质粒pNZ8148连接获得重组质粒pNZ8148-AI；
(2)从乳酸乳球菌CICC6242基因组DNA中PCR扩增获得nisRK基因及其自有启动子，并将其与线性化的质粒pNZ8148-AI连接获得重组表达载体pNZ8148-AIRK；
(3)将pNZ8148-AIRK单重转化导入乳酸乳球菌CICC6242，从而获得高效分泌Nisin的基因工程菌株。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的PCR扩增反应体系为：
其中所述上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃总延伸10min。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的PCR扩增反应体系为：
其中所述上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；最后72℃总延伸10min。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，pNZ8148-AIRK单重转化导入乳酸乳球菌CICC6242的过程为：将感受态乳酸乳球菌CICC6242与质粒pNZ8148-AIRK相混合，转移至电击装置，电压1250V、时间5ms电击，电击结束后立即加入预冷后的复苏培养液，冰上放置5min，37℃静置培养2h，800g离心5min，集菌涂布于含10μg/ml氯霉素的GM17平板上，于37℃静置培养36～48h，挑取阳性转化子培养即得提高Nisin产量的基因工程菌株。
5.一种高效分泌Nisin的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株由权利要求1～4任意一项制得。
6.如权利要求5所述的高效分泌Nisin的基因工程菌株在乳酸链球菌素生产中的应用。
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