[发明专利]一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法及其工程菌和应用

说明书

本发明公开了一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法及其工程菌和应用，本发明属于工业微生物技术领域。本发明通过来源于质粒pUC57的前乳链菌肽基因nisA和抗Nisin基因nisI、来源于乳酸乳球菌CICC6242的参与Nisin表达的调控基因nisRK及其自有启动子组成的重组质粒pNZ8148‑AIRK单重转化乳酸乳球菌CICC6242提高Nisin产量，转化过程简单，工程量小且获得的重组工程菌Nisin产量显著提高，从而在工业化生产乳酸链球菌素中具有重要价值，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法及其工程菌和应用。

背景技术

由金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌以及肉毒梭菌等革兰氏阳性致病菌感染引起的胃肠道以及呼吸道疾病严重危害畜牧业的健康发展。目前我国养殖户主要通过饲料中添加广谱抗生素来防治幼畜细菌性腹泻等多种疾病，但长期大量使用抗生素导致动物胃肠道菌群失衡，抗药性增加。同时，随着我国饲料禁抗政策的全面落实，亟需开发能抑制金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等革兰氏阳性致病菌生长，预防幼畜腹泻等胃肠道疾病的新型饲料添加剂。

1928年，Rogers和Whittier首次发现乳酸乳球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。1944年，Mattick和Hirsch发现一些乳酸乳球菌能产生蛋白类抑菌物质，命名为N-inhibitory Substance，简称Nisin(乳酸链球菌素)。此后，众多发现报道了乳酸乳球菌具有产“Nisin”的能力，并且对Nisin的生物合成进行了研究。

Nisin是乳酸乳球菌产生的一种由34个氨基酸组成的小肽，分子量约为3.5KDa，它的合成由乳酸乳球菌基因组上一个14kb的基因簇(nisABTCIPRKFEG)完成，其中nisA负责编码Nisin前体肽，nisBCP负责对该前体肽进行翻译后修饰，nisRK负责Nisin合成的调控，nisT负责将合成的Nisin从胞内转运至胞外，nisEFG和nisI负责宿主细胞对Nisin的耐药性，是两套独立的免疫系统。

Nisin耐酸，热稳定性高，对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、溶血性链球菌等大多数革兰氏阳性细菌有优良的抑菌特性，并且能改善动物肠道生态、提高机体免疫力、促进营养物质消化吸收。因此除广泛用于食品防腐外，还可成为一种优良的且极具开发潜力的饲料添加剂，用于降低幼畜腹泻疾病发病率。但目前,野生型乳酸乳球菌Nisin产量低，生产成本高是工业化生产Nisin面临的关键问题。研究发现增加Nisin产生菌中参与Nisin合成的关键基因的拷贝数能增加Nisin的生物合成，Stein等人将含有nisI的重组载体导入野生型乳酸乳球菌，使得Nisin产量提高20％。专利申请公开号为CN113025543A、专利名称为一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法的专利申请，将含有nisA的重组质粒pMG36e:nisA通过三重导入乳酸乳球菌以及将含有nisRK的重组质粒pMG36e:nisRK通过三重转化导入乳酸乳球菌，均可使Nisin产量有一定程度的提高，其中pMG36e:nisART的Nisin产量最高能到1111.5IU/ml，pMG36e:nisRK RT的Nisin产量最高达到1041.5IU/ml。但即便是1000IU/ml上下的产量对于Nisin的放大生产来说，依然成本高昂；且pMG36e:nisRK通过三重转化导入乳酸乳球菌才能提高产量，其转化工程量大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法及其工程菌和应用，以解决现有技术nisin产量不够高、转化工程量大的技术难题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种高效分泌Nisin的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)从质粒pUC57中PCR扩增获得nisAI基因，将其与线性化的质粒pNZ8148连接获得重组质粒pNZ8148-AI；