[发明专利]一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法

权利要求书

1.一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；

(2)将所述步骤(1)收集的细胞培养液差速离心，收集上清液，向上清液中先后加入(NH₄)₂SO₄和PEG 6000静置反应进行沉淀，静置后超速离心，获得外泌体；

(3)将所述步骤(2)得到的外泌体通过磁珠法提取，得到外泌体的RNA。

2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞培养液的收集时间为细胞传代后48～96h，所述步骤(1)中的脂肪间充质干细胞为P3～P6的脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述(NH₄)₂SO₄的浓度为0.2～0.4M，所述PEG 6000在所述步骤(2)中的目标体积百分浓度为4％～6％。

4.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入所述(NH₄)₂SO₄后静置反应的时间10～15min。

5.根据权利要求3或4所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入所述PEG 6000后静置反应的时间为4～6h。

6.根据权利要求5所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中差速离心具体条件为先500g离心10min，后15000g离心20min，所述(NH₄)₂SO₄静置反应后超速离心的具体条件是10000g离心5min，所述PEG 60000静置反应后的超速离心的具体条件是15000g离心30～60min。

7.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中的磁珠法的提取步骤具体为：将步骤(2)中获得的外泌体裂解、加入磁珠缓冲液吸附、离心并除杂后得到脂肪间充质干细胞的外泌体RNA。

8.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述外泌体裂解过程中，外泌体粒子数量与RNAiso Plus使用剂量的比例为5×10⁶～1×10⁷个：1mL，所述磁珠缓冲液吸附的过程中，裂解液和磁珠缓冲液的比例为200μL:50μL。

9.根据权利要求8所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述磁珠法提取的具体步骤为，将制备好的外泌体裂解液转移至1.5mL离心管中，室温静置5min，加入50μL磁珠缓冲液，振荡混匀后，静置反应3～5min，随后放在磁力架上吸附。

10.根据权利要求9所述的脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述除杂选用的试剂为氯仿和异丙醇，所述氯仿的使用剂量为200μL，所述异丙醇的使用剂量为500μL；所述氯仿的静置反应时间为5min；所述异丙醇的静置反应时间为10min；所述氯仿静置后超速离心的具体条件为12000g离心15min，所述异丙醇静置后超速离心的具体条件为12000g离心10min。