[发明专利]一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法

说明书

本发明提出了一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，涉及生物技术领域。本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，主要包括以下步骤：培养脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，向上清液中先后加入(NH₄)₂SO₄和PEG 6000静置反应进行沉淀，静置后超速离心，获得外泌体；将得到的外泌体通过磁珠法提取，得到外泌体的RNA。本发明通过特定的方法收集脂肪间充质干细胞培养液中的外泌体后进行了RNA的提取，整个过程所采用的试剂价格便宜，所使用的方法步骤简明，整个过程所花费时间相对原有提取技术表现为大幅度降低，节约了成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法。

背景技术

脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着脂肪间充质干细胞培养及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。而外泌体作为活细胞分泌的、参与细胞间调控、且携带遗传物质及大分子蛋白等多种活性因子的物质，人体树突状细胞(DCs)和T淋巴细胞(T细胞)，都可以轻松吸收和分泌外泌体，细胞间还可以通过外泌体携带的RNA交换遗传物质。因此，在研究上外泌体也被视为是未来医学的关键突破点。对于脂肪间充质干细胞的外泌体的研究将被用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；而且由于外泌体同样具有一些蛋白参与抗原呈递，结合抗原多肽，并参与将多肽装载到组织相容性复合物MHC上等特性，因此它可以作为免疫调节因子，用于治疗免疫排斥和自身免疫性等疾病。

对外泌体的遗传物质进一步的研究，可以通过脂质体包裹基因技术，以基因载体的形式，通过分子技术手段注射到细胞组织中，完成释放相应基因到指定位点，进行基因转录，调控蛋白表达进行分析研究。当然，这些试验的基础必须是以能够充分、准确地提取出间充质干细胞中外泌体的RNA为前提的。

要想研究间充质干细胞的外泌体的遗传物质或者内部代谢是否具有与别不同之处，就需要将外泌体打开，提取出外泌体的RNA和相应物质进行具体研究，但现有技术多是针对外泌体本身的提取，而外泌体内的小RNA以及与疾病相关抗原和抗体等的提取还是很少报道，其中一部分原因是由于外泌体的提取存在纯度不够，杂蛋白太多的困扰，另外，还有外泌体本身特殊的外层结构，使得裂解困难，遗传物质提取的纯度和量都受到影响。

有关外泌体的提取，由于外泌体直径大小接近病毒，相应的，其沉降系数可以清楚的将其与其他大分子物质区分开来，依据这一特性，目前主要以差速离心作为主要分离手段，再辅以聚合物沉淀、密度梯度、磁珠、过滤等化学或物理分离手段来增加外泌体提取的量和纯度，但提取花费的时间长，且对需要使用的设备要求也高，而目前市场上外泌体提取试剂盒价格也十分昂贵，对于这一技术的应用和推广造成了巨大阻力。而外泌体的RNA提取，目前也多是在细胞RNA提取方法上进行的改进，或仿照细菌裂解，在提取过程中辅以超声，或改变提取液的配比，主要目的均是想最大程度的将外泌体的外膜充分裂解，从而释放出遗传物质来，但同样存在设备要求高以及过程繁琐的问题。而常用的提取液Trizol，主要成分是异硫氰酸胍，裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。然而无论是动物、植物来源的组织还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50～100mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≧1g)均有较好的分离效果，但是对于外泌体这种直径堪比病毒的物质其作用效果实则有待考证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的外泌体RNA提取方法，为了更加快速便捷的从脂肪间充质干细胞外泌体中提取RNA，为今后的研究提供稳定可靠的技术和数据支持。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。