[发明专利]一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法

权利要求书

1.一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）接种培养：将生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株接种于生物反应器的初始培养基中，温度36~38℃发酵培养；所述初始培养基含有细胞基础培养基；

（2）补料发酵：维持步骤（1）的温度发酵培养72-144小时，开始补加补料培养基，每24小时补加一次，每次补加补料培养基的量为初始培养基体积的7%~25%；在发酵144-240小时后，调整温度至30~35℃，继续发酵培养；所述补料培养基中含有Cell Boost 2和细胞基础培养基；

其中，所述发酵培养的条件是：pH为6.7~7.05，溶氧量30%~50%，搅拌转速100~150 rpm；所述生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株为：含有人VIII-Fc基因和人IGG1 Fc片段基因的二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞株CHO DG44，所述人VIII-Fc基因的序列如SEQID NO.1所示，人IGG1 Fc片段基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基或OPM-CHO CD11V培养基；

所述初始培养基中还添加有铜离子，所述铜离子浓度为40~80 μM/L；

所述补料培养基中还添加有铜离子，所述铜离子浓度为40~80 μM/L，所述补料培养基中Cell Boost 2的含量为1%~3%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始培养基中铜离子浓度为40μM/L，所述补料培养基中铜离子浓度为40μM/L，所述补料培养基中Cell Boost 2的含量为2%。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述接种的细胞密度为30~100万/mL。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述接种的细胞密度为35万/mL。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵培养温度为37℃。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述调整温度为34~35℃。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为OPM-CHO CD11V培养基，所述补加补料培养基的量为：

第1~4次每次补加初始培养基体积的7~10%；

第5~6次每次补加初始培养基体积的11~14%；

之后每次补加初始培养基体积的19~22%。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为OPM-CHO CD11V培养基，所述补加补料培养基的量为：第1~4次每次补加初始培养基体积的8.3%；

第5~6次每次补加初始培养基体积的12.5%；

第7~11次每次补加初始培养基体积的20.8%。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基培养基，所述补加补料培养基的量为：

第1~4次每次补加初始培养基体积的7~9%；

第5~7次每次补加初始培养基体积的9~14%；

之后每次补加初始培养基体积的7~9%。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基培养基，所述补加补料培养基的量为：第1~4次每次补加初始培养基体积的7.2%；

第5~7次每次补加初始培养基体积的9.6%；

第7~11次每次补加初始培养基体积的7.2%。

11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件是：pH为6.9~7.0，溶氧量40%，搅拌转速130 rpm。