[发明专利]一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法

说明书

本发明提供了一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法，包括在pH为6.7～7.05，溶氧量30％～50％，搅拌转速100～150rpm条件下，向含有细胞基础培养基中接种生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株，并多次补加含有Cell Boost 2和细胞基础培养基的补料培养基的步骤。本发明培养方法细胞活率高、培养周期长、发酵液体积大，且单位体积产长效重组人凝血因子VIII的产量高，具有非常好的产业化推广应用价值。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的发酵培养方法。

背景技术

血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病,病症多为自发性或轻度外伤后出血不止,轻则造成患者终生残疾,重则短时间即可危及患者生命。血友病尚无根治办法,目前的治疗方法主要为替代疗法,通过长期输注血浆、缺失的凝血因子的方式来治疗。人凝血因子VIII(coagulation factor VIII，FVIII)是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子，作为凝血因子IXa的辅因子，参与凝血因子X的激活。FVIII遗传性缺乏将导致甲型血友病(或血友病A)。静注FVIII制品替代治疗甲型血友病，是当前的主要治疗手段。由于静注天然结构的FVIII在体内半衰期短，预防性治疗需要一周静注3-4次，开发长效FVIII有助于提高治疗便利性和患者依从性。长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白能明显提高FVIII的稳定性和体内半衰期，达到降低预防性治疗每周用药频次的目的。目前，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是通过质粒转染生产长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的最主要载体细胞之一。

然而，凝血因子VIII的体外表达水平比在哺乳细胞中生产的其它重组蛋白质低至少两到三倍，导致其生产过程产能较低。为了满足大量的需求，往往通过对细胞克隆、培养介质的改进以期提高其体外表达水平，但改进难度大、成本高、周期长。因此，如果能通过对产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的发酵培养工艺进行改进，提高产能产量，将具有非常重要的产业意义。

在哺乳动物细胞培养过程中产生和积累的毒性代谢物及生长抑制代谢物，如乳酸已广为人知。作为细胞中枢代谢中的主要毒性代谢产物之一，乳酸抑制细胞生长，诱导细胞凋亡并减少重组治疗产品的表达水平。乳酸浓度持续升高与产物表达量下降的关联在CHO细胞中几乎成为一种共识。目前，针对在细胞培养过程中出现代谢废物这一现象，已经有许多试图解决该问题的细胞工程策略，如使用RNA干扰技术下调乳酸脱氢酶A(LdhA)的表达，可降低乳酸的产生，但不影响细胞生长且也不影响人血小板生成素的表达水平；通过过表达苹果酸-天冬氨酸穿梭途径(MAS)中的Aralar1，乳酸的代谢从产生转变到消耗；保持果糖转运蛋白(GLUT5)的稳定表达，避免碳源转化为乳酸；通过人丙酮酸羧化酶的过表达或密码子优化导致乳酸产量显著下降，细胞表达水平显著提升并改善目的蛋白糖基化。上述研究都涉及到基因的调控，引入新的DNA、RNA或者过表达非治疗用目的蛋白，还需要对终产品的临床安全性做全方位的评估，步骤非常繁杂且成本和工艺要求高，不适于大规模推广。