[发明专利]罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法

权利要求书

1.罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，利用在液体培养基中直接获得的罗中链霉菌TRM 49605菌丝体为供体细胞，与受体细胞大肠杆菌进行结合转移，得到接合子，再对接合子进行纯化与培养。

2.根据权利要求1所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，罗中链霉菌TRM 49605菌丝体供体细胞的培养：在甘油管中保存的罗中链霉菌TRM49605菌丝体，直接接种于TSB菌丝体生长培养基培养基。

3.根据权利要求2所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，在TSB菌丝体生长培养基中：30℃220rpm/min摇床上培养30h。

4.根据权利要求1所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，受体细胞大肠杆菌ET12567的培养：挑取大肠杆菌ET12567单菌落，接种于5mL的LB大肠杆菌液体液体培养基，加入氯霉素、安普霉素和卡那霉素混合抗生素溶液，进行培养。

5.根据权利要求4所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，氯霉素、安普霉素和卡那霉素混合抗生素溶液中：5μL的25mg/mL的氯霉素，2.5μL的50mg/mL的安普霉素和2.5μL的50mg/mL卡那霉素，然后在37℃培养12h。

6.根据权利要求1所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，供体细胞与受体细胞结合转移方法：将罗中链霉菌TRM49605菌丝体和大肠杆菌菌体先分别用LB大肠杆菌液体培养基洗涤2遍后重悬菌体，按照供体细胞罗中链霉菌TRM 49605菌丝体和受体细胞大肠杆菌的数量比为100:1的比例混合，涂布于高氏一号接合转移培养基平板上，再用萘啶酮酸和安普霉素溶液覆盖，使溶液均匀铺满整个平板，吹干后，置于培养箱中培养。

7.根据权利要求6所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，供体细胞罗中链霉菌TRM 49605菌丝体和受体细胞大肠杆菌混合后，涂布于高氏一号接合转移培养基平板上置于37℃培养箱中培养约16～20h，再加入抗生素液体覆盖，抗生素液体为1mL的灭菌ddH₂O中添加母液浓度为50mg/mL的安普霉素10μL和母液浓度为25mg/mL的萘啶酮酸20μL，使溶液均匀铺满整个平板，吹干后，置于30℃培养箱中培养5-7天。

8.根据权利要求1所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，接合子进行纯化与培养：随机挑取接合子，划线于含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基上，在培养箱中培养，挑取菌丝，接种于TSB菌丝体生长培养基中培养，用于基因组抽取。

9.根据权利要求8所述的罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，划线于高氏一号接合转移培养基上，在30℃培养箱中培养5天，挑取菌丝，接种于TSB菌丝体生长培养基中培养36h，得到纯化后的接合子，用于基因组抽取和PCR验证；含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基的制备方法为：100mL的TSB菌丝体生长培养基，灭菌后冷却，再往培养基中加入200μL的浓度为25mg/mL的萘啶酮酸和100μL的浓度为50mg/mL的安普霉素，使得萘啶酮酸的终浓度为50μg/mL,安普霉素的终浓度为50μg/mL。