[发明专利]罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法

说明书

本发明公开罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，利用罗中链霉菌TRM 49605菌丝体为供体细胞，与受体细胞大肠杆菌进行结合转移，得到接合转移转化子，再对接合子进行纯化与培养。本发明大肠杆菌与罗中链霉菌TRM 49605的接合转移作，不依赖于原生质体的形成与再生；可以避开宿主菌的限制性系统障碍；可利用件实现载体高效的从大肠杆菌向链霉菌中转移；用于接合转移的质粒都是穿梭质粒，大肠杆菌中这些质粒能够自主复制，更加方面表达载体的构建和操作。

技术领域

本发明涉及遗传操作体系技术领域。具体地说是罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法。

背景技术

链霉菌可以产生丰富的次级代谢产物而且具有复杂的形态分化过程，在基础研究和工业应用方面都有极大的价值，再加上链霉菌可以产生多种抗细菌、抗真菌、抗肿瘤活性的抗生素，目前链霉菌已成为微生物研究中的重点。罗中链霉菌(Streptmycesluozhongensis)TRM 49605是由本发明技术人员所在实验室发现的具有我国自主知识产权的链霉菌新种，也是衣霉素(tunicamycin)的产生菌。罗中链霉菌TRM 49605接合转移体系的建立及优化是对该链霉菌的调控基因和次级代谢产物合成基因进行研究的必要前提。同时，遗传操作体系的构建也使得有目的地对罗中链霉菌TRM 49605进行定向改造基因、提高其基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物等成为可能，为实现基因工程菌株的构建和提高链霉菌的抗生素产生能力奠定基础。

建立合适高效的遗传操作系统是对菌种进行基因改造的重要前提。属间接合转移以其简便性、高效性的优点广泛应用于链霉菌的基因操作之中。传统链霉菌接合转移主要依靠大肠杆菌(Escherichia coli)萌发的性菌毛和链霉菌孢子萌发的菌丝发生接触时进行基因转移。

因此对菌株孢子预萌发的状态进行摸索很有必要，除此之外还需要对热激温度和时间、供受体比例、抗生素覆盖时间进行摸索，以确定最佳的接合转移条件。如遗传背景十分清楚的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，常规方法为刮取在MS平板上生长5-6天的新鲜孢子，用2×YT培养基洗涤次2次，50℃热激10min，迅速冷却至室温。将处理好的供体大肠杆菌ET12567(pUZ8002，pSET152)按1:1比例与天蓝色链霉菌孢子悬浮液混合，均匀涂布在MS培养基上，30℃培养15-16h，用1mL含抗生素和萘啶酮酸(作用浓度均为50μg/mL)的无菌水溶液覆盖。30℃继续恒温培养5-7天直至接合子长出。

然而罗中链霉菌TRM 49605，前期研究发现，罗中链霉菌TRM 49605其菌丝发达，但无明显孢子产生。传统的链霉菌接合转移操作并不能适用于不易产孢和难以培养的放线菌。也有报道，对于不产孢子的菌，可采用电转或原生质体转化进行处理，但是方法复杂。

目前对于罗中链霉菌TRM 49605的接合转移操作还没有成功报道，为方便后续对罗中链霉菌TRM 49605进行基因改造，因此有必要对TRM 49605的遗传操作体系进行构建。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，为有目的地对罗中链霉菌TRM 49605进行定向改造基因、提高其基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物等提供方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，利用在液体培养基中直接获得的罗中链霉菌TRM 49605菌丝体为供体细胞，与受体细胞大肠杆菌进行结合转移，得到接合子，再对接合子进行纯化与培养。

上述罗中链霉菌TRM 49605遗传操作体系的构建方法，罗中链霉菌TRM 49605菌丝体供体细胞的培养：在甘油管中保存的罗中链霉菌TRM 49605菌丝体，直接接种于TSB菌丝体生长培养基培养基。