[发明专利]一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法

权利要求书

1.一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：

在所述蜜蜂胚胎单细胞的收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨所述蜂卵，具体包括：

将通过移虫针收集的200只蜂卵样品置于含有1ml所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液的1.5ml的离心管中；

将所述离心管中的蜂卵细胞进行第一次消化的过程：吸除所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液，加入200微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液在所述离心管中，用1.5ml离心管研磨棒于插入冰里的所述离心管中对所述蜂卵样品充分研磨，直至看不见完整卵壳；用300微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液冲洗该研磨棒，使该研磨棒上细胞充分洗脱至该离心管中，再将该离心管置于37℃水浴锅中，水浴5min；

还包括将未完全消化的卵壳组织进行第二次消化的过程：吸除所述离心管中的上清，加入500微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液将蜂卵细胞吹散，再将所述离心管放置于37℃水浴锅中水浴3min。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：对所述离心管中经第一次消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程：将所述离心管放置在提前预冷至4℃的离心机中，以转速800rpm旋转离心3min。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括：对所述离心管中经第二次消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程：将所述离心管放置于提前预冷至4℃的离心机中，以转速1000rpm旋转离心3min。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：用磷酸缓冲盐溶液重悬蜜蜂胚胎细胞，具体为：吸除所述离心管中的上清，加入50微升含1％牛血清白蛋白的所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液进行重悬细胞处理，即用平口枪头轻轻吹打管中消化的蜂卵细胞。