[发明专利]一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法

说明书

本发明披露了一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：在蜜蜂胚胎单细胞的收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中不合钙、镁离子的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除所述磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨所述蜂卵。在对离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理后，将离心管中未完全消化的卵壳组织进行二次消化；然后对该离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域里蜜蜂单细胞转录组技术，尤其涉及蜜蜂胚胎单细胞的制备方法。

背景技术

单细胞转录组有助于深入理解基因型和表型之间的相互关系。随着高通量测序技术的不断成熟，单细胞测序技术成为备受关注的强大工具。在多细胞生物个体发育过程中，单个卵细胞分裂产生胚胎干细胞，进而能增殖分化成为具有不同表型和功能的任何类型的细胞。细胞间差异和异质性是干细胞群体固有的基本特性。对单个小鼠卵裂细胞的转录组分析发现，在相同的卵母细胞中至少有8-19％的基因存在两个以上的转录异构体(Tang etal.2009)，这表明在胚胎发育过程中单细胞转录组表型的复杂性。如果对一群细胞进行组学分析，这些关键的信息就会被掩盖。单细胞转录组技术可以用在同种干细胞中全面剖析细胞异质性，鉴定不同表型的细胞，这将大大提高人们对胚胎发育中单细胞水平遗传信息异质性的理解，为深入阐明蜜蜂胚胎发育的分子机理开辟新途径和思路。目前，已经利用单细胞转录组技术陆续对拟南芥(Palovaara et al.2017)、果蝇(Karaiskos et al.2017)、小鼠(Peng et al.2020)和人类(Guo et al.2015)的胚期发育进行了研究，解析了其基因调控的机制，并绘制了相应的胚胎发育轨迹。

目前已有人对蜜蜂大脑的单细胞转录组研究，通过对蜜蜂大脑的单细胞转录组分析发现，感染残翅病毒(DWV-A)的蜜蜂大脑基因表达谱与采集蜂相似，导致蜜蜂采集行为的提前发生以及蜜蜂学习行为的损伤，并最终会造成染病蜜蜂错误归巢进而扩大病毒的感染范围(Traniello et al.2020)，为蜜蜂健康和群体生存的机制提供了新的见解。

在进行蜜蜂单细胞转录组实验前，需获取蜜蜂胚胎期细胞。蜜蜂的卵呈乳白色，香蕉形，长度为1.5-1.8毫米。外表面为卵壳，内部充斥卵液。为获取卵内细胞，需对蜜蜂卵进行研磨，并通过胰酶进行消化，以获得蜜蜂胚胎期细胞。用传统的细胞制备方法所得到蜜蜂胚胎细胞存活率很低，如图1所示，图中空心圈代表活细胞，不规则的黑色实心点代表死细胞，通常它仅有45.5％的胚胎细胞存活率，无法满足后续的蜜蜂单细胞转录组的实验要求。因此，需对现有的蜜蜂胚胎期细胞制备方法进行改进，以满足科研实验的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，能够有效地提高蜜蜂胚胎细胞存活率。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：在所述蜜蜂胚胎单细胞的收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除所述磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨所述蜂卵。

优选地，使用的磷酸缓冲盐溶液是不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液。

优选地，所述方法具体包括：

将通过移虫针收集的200只蜂卵样品置于含有1ml不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液的1.5ml的离心管中；

吸除该磷酸缓冲盐溶液，加入200微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液在离心管中，用1.5ml离心管研磨棒于插入冰里的离心管中对所述蜂卵样品充分研磨，直至看不见完整卵壳；用300微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液冲洗该研磨棒，使该研磨棒上细胞充分洗脱至该离心管中，再将该离心管置于37℃水浴锅中，水浴5min。

优选地，该方法还包括：对离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程。