[发明专利]一种从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法

权利要求书

1.一种从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：包括复苏流程和扩增流程，

所述复苏流程包括：

A1、对储存有脐带血的冻存袋进行复苏处理；

A2、将5％-10％人血白蛋白的复苏液缓慢注入冻存袋并静置，得到细胞悬液；

A3、将细胞悬液转移至第一离心管中；

A4、将0.9％氯化钠注射液注入冻存袋进行洗涤，并将冻存袋中的全部液体转移到第一离心管中；

A5、对第一离心管进行离心处理，得到所需细胞悬液；

所述扩增流程包括：

B1、在培养瓶中加入复苏步骤中获取的所需细胞悬液以及CUNK-2和血清替代物的混合液；

B2、将培养瓶置于恒温培养箱中静置培养，培养过程中每2-3天进行一次补液。

2.如权利要求1所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述离心处理包括：

A51、对第一离心管进行第一次离心处理；

A52、去除第一离心管中的上清液，对第一离心管进行第一次稀释，得到稀释混合液；

A53、将稀释混合液转移至第二离心管中，所述第二离心管中含有Ficol l；

A54、对第二离心管进行第二次离心处理；

A55、吸取白膜层至第三离心管，对第三离心管进行第二次稀释；

A56、对第三离心管进行第三次离心处理；

A57、去除上清，对第三离心管进行定容稀释；

A58、对第三离心管进行第四次离心处理；

A59、去除上清，使用NK培养基进行重悬混匀，得到所需细胞悬液。

3.如权利要求2所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述第一次离心处理的参数为400g离心力下离心15min；

所述第二次离心处理的参数为400g离心力下离心30min；

所述第三次离心处理的参数为400g离心力下离心10min；

所述第四次离心处理的参数为200g离心力下离心10min。

4.如权利要求3所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：在步骤B2之中，补液具体包括：

B21、培养第4天，加入20mL的NK培养基、0.25支的CUNK-2及3mL的血清替代物的混合液；

B22、培养第6天，加入40mL的NK培养基、0.5支的CUNK-2及6mL的血清替代物的混合液；

B23、培养第8天，将培养瓶中的培养悬液转移至细胞培养袋中，并加入100mL的NK培养基与0.1支的CUNK-3的混合液；

B24、培养第10天，加入200mL的NK培养基与0.2支的CUNK-3的混合液；

B25、培养第12天，加入400mL的NK培养基与0.4支的CUNK-3的混合液；

B26、培养第14天，加入600mL的NK培养基与0.6支的CUNK-3的混合液；

B27、培养第16天，加入600mL的NK培养基与0.6支的CUNK-3的混合液。

5.如权利要求4所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：在步骤B1之前还包括对培养瓶进行包被处理，所述包被处理包括：

B01、在培养瓶中加入CUNK-1和DPBS，摇晃混匀后得到包被液并在37±1℃的恒温箱中静置；

B02、去除培养瓶中的包被液的上清，得到具有包被的培养瓶。

6.如权利要求5所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：在步骤B01之中，所述CUNK-1的数量为1支，所述DPBS为13mL。

7.如权利要求6所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：在步骤B01之中，静置时长为至少2小时。

8.如权利要求7所述的从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，其特征在于：在步骤B2之中，恒温培养箱的培养环境温度为37±1℃，湿度为5.0±0.2％。