[发明专利]一种从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法

说明书

本发明提供了一种从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，包括复苏流程和扩增流程。本发明的有益效果在于：通过对冻存的脐带血进行复苏及提纯，获得淋巴细胞，再对淋巴细胞中的NK细胞选择性刺激扩增，扩展了冻存脐带血的应用方向，提纯后的淋巴细胞活性高，不需要对细胞进行分选，不需要使用滋养层细胞，也不需要使用血浆，降低了操作复杂性，降低了成本，扩增后的NK细胞数量多，纯度高，符合临床应用需求。

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其是指一种从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法。

背景技术

脐带血中含有CD34+造血干细胞，具备较强的分化能力，且免疫原性低，带来的供受者之间的免疫排斥反应少等优势，脐血造血干细胞治疗技术已应用于11种重大疾病的治疗：急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、严重放射病、再生障碍性贫血、严重贫困、部分遗传病一些先天性疾病、部分代谢性疾病、淋巴瘤等恶性肿瘤。

因此，在我国脐带血作为一种重要的生物资源被进行储存，截止当前，中国脐带血的储存量已经达100万份以上，且储存量还会逐年大幅增加。

近些年，随着对脐带血研究的深入，发现脐带血中除了含有造血干细胞之外，还含有其他丰富的免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、调节性T细胞、单核细胞等，也在逐渐被发掘应用。调节性T细胞是一类免疫抑制细胞、可以用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病；单核细胞是一类免疫调节细胞，可应用于新生儿缺氧缺血脑病等；T细胞是一类具有杀伤癌细胞能力的免疫细胞，脐血来源的T细胞改造来的CAR-T细胞也具有很好的应用前景；NK细胞是一类不依赖于MHC分子的天然杀伤细胞，细胞更加原始，可以用于乳腺癌、多发性骨髓瘤等多种癌症治疗，基因编辑改造的CAR-NK也具有良好的应用价值。

现有从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法，多数需要使用新鲜脐带血，且主要对细胞分选出CD3阴性细胞扩增。

因此，为了扩展脐带血的应用，需要开发出一种针对储存的脐带血大量扩增NK细胞的方法，以满足未来市场需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种不需要对细胞进行分选，不需要使用滋养层细胞，也不需要使用血浆,能够从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种从储存的脐带血中扩增NK细胞的方法，包括复苏流程和扩增流程，

所述复苏流程包括：

A1、对储存有脐带血的冻存袋进行复苏处理；

A2、将5％-10％人血白蛋白的复苏液缓慢注入冻存袋并静置，得到细胞悬液；

A3、将细胞悬液转移至第一离心管中；

A4、将0.9％氯化钠注射液注入冻存袋进行洗涤，并将冻存袋中的全部液体转移到第一离心管中；

A5、对第一离心管进行离心处理，得到所需细胞悬液；

所述扩增流程包括：

B1、在培养瓶中加入复苏步骤中获取的所需细胞悬液以及CUNK-2和血清替代物的混合液；

B2、将培养瓶置于恒温培养箱中静置培养，培养过程中每2-3天进行一次补液。

进一步的，所述离心处理包括：

A51、对第一离心管进行第一次离心处理；

A52、去除第一离心管中的上清液，对第一离心管进行第一次稀释，得到稀释混合液；

A53、将稀释混合液转移至第二离心管中，所述第二离心管中含有Ficoll；

A54、对第二离心管进行第二次离心处理；