[发明专利]一种天目地黄的遗传转化方法

权利要求书

1.一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、天目地黄PDS基因克隆

根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄RgPDS1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的PCR引物，以天目地黄的cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增天目地黄PDS基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)、CRISPR/Cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌

克隆步骤(1)得到的天目地黄PDS基因，在外显子上靠近ATG的一端选取一段能够被Cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgRNA靶序列插入到CRISPR/Cas9基因编辑载体中，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中sgRNA由拟南芥U6启动子驱动，zCas9基因由花椰菜病毒的35S启动子驱动，获得天目地黄PDS基因的CRISPR/Cas9表达载体，然后将成功构建的CRISPR/Cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；

(3)、天目地黄遗传转化

以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成0.5～1.0cm大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的MS液体培养基中，5～10min后将外植体移至含有80～120μmol/L乙酰丁香酮的MS固体共培养培养基中，24～26℃下暗培养2～3d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含150～300mg/L特美汀、50-100mg/L卡那霉素、0.05mg/L NAA和2.0mg/L 6-BA的MS固体分化培养基中，25～27℃下光培养，待抗性芽长至2～3cm时，切取抗性芽转入MS生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：

MS共培养培养基、分化培养及和生根培养基的pH值均为5.5～6.0；

(4)、转基因植株的分子检测

利用CRISPR/Cas9表达载体的Cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行PCR分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的T-DNA序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。

2.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，还包括步骤(5)转基因植株靶位点DNA序列分析：

提取步骤(4)得到的阳性转基因植株的基因组DNA，在基因编辑的靶点序列前后设计特异引物进行PCR扩增，扩增产物胶回收并连接TA克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序，或回收PCR扩增产物进行高通量二代扩增序列测序，确定靶点序列是否突变以及突变的类型，若已经突变，靶点序列存在核苷酸碱基缺失、插入或替换；若未突变，靶点序列核苷酸碱基没有变化。

3.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中所述地黄RgPDS1基因的NCBI登记号MW132596。

4.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中所述特异的PCR引物包括正向引物RcPDS1_F和反向引物RcPDS1_R，其中：

正向引物RcPDS1_F：5’-CAGTTGCCTGAGCTGTTGAA-3’；

反向引物RcPDS1_R：5’-GCTTCCCTATCTTCTGTCTTCC-3’。

5.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体含有卡那霉素抗性基因。

6.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中所述光培养为每天光照培养14h，暗培养10h。

7.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中所述2对特异引物包括第一特异引物和第二特异引物；

第一特异引物正向引物Cas9_F：5’-TCAACGGCATTCGGGACAAG-3’；

第一特异引物反向引物Cas9_R：5’-CCACATACATATCGCGGCCA-3’；

第二特异引物正向引物pKSE401_F：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；

第二特异引物反向引物sgRcPDS1_R：5’-CCCAGCACATCCCTTGCTT-3’。