[发明专利]一种天目地黄的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)、天目地黄PDS基因克隆；(2)CRISPR/Cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌；(3)天目地黄遗传转化；(4)、转基因植株的分子检测。本发明具有以下有益效果：1.天目地黄的叶片愈伤褐化率显著降低，再生芽分化率高，再生芽的生长状态较好；2.遗传转化效率的鉴定方法有改进；3.近缘物种地黄的分化培养基中生长素NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，同样的NAA浓度用于天目地黄遗传转化，再生芽分化率很低，改进NAA的浓度为0.05mg/L时，天目地黄的再生分化率显著提高。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种天目地黄的遗传转化方法。

背景技术

天目地黄(Rehmannia chingii)性寒，味甘、苦，因其主要分布在浙江天目山一带，又称为浙地黄，是地黄属重要的野生种质资源之一。

据民间用药记载，天目地黄以全草和根入药，具有清热凉血、养阴生津和补益肝肾的功效。天目地黄富含环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、地黄苷、益母草苷及多糖类成分。已有研究表明，天目地黄的全草及根中均含有丰富的梓醇和毛蕊花糖苷，在抗菌、抗炎、降血糖及神经保护等多方面具有重要的药理活性。当前迅速发展的转录组学、代谢组学和功能基因组学为揭示天目地黄药效成分生物合成的分子机制、保障天目地黄药材的品质提供了契机。然而，目前天目地黄的遗传转化体系尚未见报道，建立高效的遗传转化体系对于研究天目地黄生长发育、逆境胁迫及次生代谢产物的合成机制意义重大。

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的沉默或缺失会抑制类胡萝卜素的正常合成，从而影响类胡萝卜素对叶绿素的保护，造成富含叶绿素的绿色植物褪色而呈现白化现象。因此，利用CRISPR/Cas9系统敲除PDS基因能够非常直观的检验遗传转化体系及其转化效率。

本发明利用根癌农杆菌介导的叶盘法对CRISPR/Cas9基因编辑载体进行转化，首次实现了对天目地黄的遗传转化，并成功的对天目地黄PDS基因的基因组DNA靶序列进行定向修饰，对于天目地黄的功能基因组学研究奠定了基础。

天目地黄遗传转化的方法目前未见相关报道。虽然其近缘种地黄的遗传转化已经建立，然而，由于两个物种的遗传差异较大，利用地黄遗传转化的方法进行天目地黄的遗传转化效率很低。探索一种高效的根癌农杆菌介导的天目地黄遗传转化的方法成为急需解决的技术问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一种天目地黄的遗传转化方法，实现了利用CRISPR/Cas9系统对天目地黄目标基因进行定向敲除。

本发明通过将携带有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌与天目地黄外植体进行共培养，使得外源T-DNA片段插入到外植体基因组，经过抗生素筛选后，获得抗性植株，通过目标基因靶位点序列分析获，即可获得靶基因突变的天目地黄再生植株，从而实现了本发明的目的。

技术方案：一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)、天目地黄PDS基因克隆

根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄RgPDS1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的PCR引物，以天目地黄的cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增天目地黄PDS基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)、CRISPR/Cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌