[发明专利]肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法

权利要求书

1.NRAV在制备用于仑伐替尼耐药的诊断标记物中的用途，其特征在于，包括以下步骤，

S1：分别构建仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感的肝癌细胞；

S2：高通量筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子；

S3：分析步骤S2中筛选出来的新分子NRAV在仑伐替尼耐药和敏感肝癌细胞及组织中的表达水平；

步骤S2的具体操作包括以下步骤，

S201：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分析仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感两组肝癌细胞差异的lncRNAs；

S202：筛选仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌细胞中显著高表达的lncRNAs；

步骤S3的具体操作包括以下步骤，

S301：提取肝癌蜡块组织总RNA，检测NRAV水平；

S302：根据临床数据分析NRAV与肝癌预后以及不同化疗方案患者预后的关系；

S303：合成NRAV特异性探针后采用组织荧光探针原位杂交技术检测NRAV在仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌患者肿瘤组织中的水平。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤S301的具体操作包括以下步骤，

S3011：将肝癌蜡块样品切成5-10μm厚的片状，并迅速将切片置于1.5 ml 无RNA酶的离心管中，加入1 ml二甲苯，剧烈涡旋10s，室温下12,000 rpm离心2 min；

S3012：用枪头吸除上清，然后加入1 ml 无水乙醇并混匀，室温下12,000 rpm离心2min；

S3013：用枪头吸除上清，室温或37℃放置10 min直至残余的乙醇挥发完全；

S3014：加入200μl裂解液以及10μl蛋白酶K并充分混匀，55℃孵育15min，80℃孵育15min，室温下12,000 rpm离心5 min，转移上清至新的无RNA酶离心管中；

S3015：在转移后的上清中加入220μl的缓冲液RB混匀，然后加入660 μl的无水乙醇并充分混匀；

S3016：取700μl步骤S3017中形成的溶液和沉淀，转移至吸附柱中，12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中，重复此步骤，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱；

S3017：向吸附柱中加入80 μl的DNase I工作液，室温静置15 min，然后再向吸附柱中再加入500μl去蛋白液RW，室温下12,000 rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；

S3018：向吸附柱中再加入500μl洗液RW，室温静置2 min，12,000 rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；重复该步骤多次，将吸附柱置于室温静置5min后转入新的无RNA酶离心管，悬空滴加30- 100μl DEPC水，室温静置5 min，12,000 rpm离心2 min，离心管底即为RNA；

S3019：采用步骤S202中的方法对离心管底的RNA进行逆转录，以及RT-PCR检测NRAV水平。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤S303中合成NRAV特异性探针后进行组织荧光探针原位杂交，具体操作步骤如下：

S3031：石蜡组织样本依次进行烤片、脱蜡、浸泡、切片、消化、清洗和再浸泡处理；

S3032：对每块组织切片进行预杂交、杂交和清洗；

S3033：对杂交处理后的切片进行DNA染色；

S3034：避光条件下进行封片。