[发明专利]冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用

说明书

本发明公开了一种人肾上皮细胞冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用，本发明冻存液包括以下质量百分含量的组份：玉米糊精0.001～0.01％、聚甘油1～20％、三羟甲基氨基甲烷0.01～0.05％、L‑天门冬氨酸0.001～0.005％、磷酸二氢钠0.1～0.4％、磷酸氢二钠0.2～0.8％、PBS缓冲液10～25％，余量为注射用水。本发明不包含二甲基亚砜、乙二醇等毒性分子和胎牛血清、蛋白等价格昂贵的动物源组分，并且复苏后，293细胞的存活率、增殖能力以及细胞形态均优于现有的含DMSO冻存保护剂。本发明的冷冻保存液组分绿色无毒、来源方便、成本低廉，是一种可靠的人肾上皮细胞冷冻保存手段。

技术领域

本发明涉及低温冻存技术领域，特别涉及一种人肾上皮细胞冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用。

背景技术

哺乳动物细胞作为蛋白的表达系统具有糖基化、乙酰化、硫酸化、硫酸化等翻译后修饰。而蛋白翻译后修饰，如糖基化修饰，会直接影响蛋白在体内的半衰期及稳定性和生物学活性、影响配体识别及结合，影响其免疫原性，影响胞间作用等功能。CHO细胞、BHK细胞、Sp2/0等细胞常被用于制备生物制药。然而这些小鼠来源的细胞与293细胞相比，缺乏人的细胞翻译后修饰系统，因此与人源系统表达的蛋白有差异。目前，293细胞因其具有转染效率高、表达蛋白结构最接近其在人体内构象等优势，被广泛用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被等。

在293细胞的科学研究和实际应用中，经常需要将细胞冷冻保存以满足长途运输或长期保存的需求。低温保存过程中不可控制的结冰会对细胞造成严重的机械损伤，从而直接造成细胞直接失活。因此冻存液是293细胞冻存必须使用的一种保护剂，传统的冷冻保存剂通常含有DMSO、乙二醇等小分子物质，这些小分子物质是渗透性的，可透过细胞膜进入细胞内部，增强细胞内水份的玻璃化能力，使细胞内水分在快速降温过程中直接进入玻璃态从而避免结冰。但DMSO具有细胞毒性，浓度越高对细胞危害越大，并且冻存后细胞状态也不佳；其次，含DMSO冻存液在复温过程中也会再次结冰和冰晶重结晶，目前常用的传统冷冻保存剂并不具有控制冰晶成核生长和抑制冰重结晶的效果，因此无法避免复温过程中的冰晶对细胞造成的损伤。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于，提供一种冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用。所述冻存液的配方合理，具有抑制冰核形成、调控冰晶形貌和抑制冰晶重结晶的功能，从而降低冰晶对保存样品的机械损害。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：

一种冻存液的制备方法，其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：玉米糊精0.001％～0.01％、聚甘油1％～20％、三羟甲基氨基甲烷0.01％～0.05％、L-天门冬氨酸0.001％～0.005％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液10％～25％，余量为水,优选为注射用水；

(2)往所述水中先加入玉米糊精、聚甘油、三羟甲基氨基甲烷，再加入L-天门冬氨酸搅拌混合均匀，获得混合溶液；

(3)在混合溶液冷却至室温后，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH至6.2～8.2，并加入PBS缓冲液定容至预定体积，制得冻存液。

所述玉米糊精、三羟甲基氨基甲烷、L-天门冬氨酸可以通过氢键和疏水相互作用，在冰核形成后，特异性地吸附在冰晶晶面上，从而抑制了冰晶生长。并且上述成分在复温过程中，还可以吸附在冰晶界上，阻碍冰畴间水分子的扩散，从而抑制冰晶重结晶，保护细胞免受冻伤。所述聚甘油可以通过羟基和羧基水合部分自由水，降低可结冰水的比例。减少冻存中冰晶生成数量。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和PBS缓冲溶液可调节冻存液的pH，使其维持在6.2～8.2之间。

一种所述的冻存液在人肾上皮细胞(293)冷冻保存中的应用，应用步骤如下：