[发明专利]一种检测样品中多聚泛素化信号的检测方法

权利要求书

1.一种检测样品中多聚泛素化信号的检测方法，包括下述步骤：

1)提供待测样品；

2)将待测样品与至少一种包含杂合泛素结合结构域多肽的检测试剂接触；

3)获得可读取的检测结果；

其中步骤1)所述待测样品为石蜡包埋组织样品，或原位组织细胞；

步骤2)所述包含杂合泛素结合结构域多肽的检测试剂为下述之一：

A.与化学标记物连接的杂合泛素结合结构域多肽；或

B.与荧光标记物连接的杂合泛素结合结构域多肽。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中步骤2)所述的检测试剂为与辣根过氧化物酶连接的杂合泛素结合结构域多肽。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其中步骤2)所述的检测试剂为与荧光素连接的杂合泛素结合域结构多肽。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其中所述杂合泛素结合结构域多肽与一谷胱甘肽-S-转移酶标签连接，并通过一活性化学反应基团与3-4分子的化学标记物或荧光标记物连接。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中所述的活性化学反应基团选自碘乙酰胺、苄基卤化物和溴甲基酮，或可与蛋白或多肽中半胱氨酸、活性氨基反应的化学基团。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其中所述的发光基团为能够进行化学检测的荧光素或者化学酶促发光蛋白，包括荧光蛋白、不同波长的荧光素、辣根过氧化物酶等化学酶促发光蛋白。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其中所述活性化学反应基团为马来酰亚胺。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述方法应用于细胞中多聚泛素化信号的原位荧光检测，包括下述步骤：

8a)提供培养细胞作为待测样品；

8b)将步骤8a)的待测样品与包含杂合泛素结合结构域多肽的检测试剂接触，所述检测试剂为与荧光标记物连接的杂合泛素结合结构域多肽；

8c)将步骤8b)的细胞进行荧光信号检测，获得检测结果。

9.根据权利要求8所述的方法，包括下述步骤：

9a)培养细胞至合适的密度；

9b)以步骤9a)获得的细胞，进行4％多聚甲醛固定和0.5％TritonX-100打孔；

9c)将步骤9b)的细胞进行5％BSA封闭；

9d)将步骤9c)的细胞与所述的检测试剂进行孵育结合；

9f)将步骤9d)的细胞进行荧光信号检测。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法应用于石蜡包埋样品或组织细胞中多聚泛素化信号的原位检测，包括下述步骤：

10a)提供石蜡切片作为待测样品；

10b)将步骤10a)的待测样品与包含杂合泛素结合结构域多肽的检测试剂接触，所述检测试剂为与辣根过氧化物酶连接的杂合泛素结合结构域多肽；

10c)将步骤10b)的切片显色并读取信号，获得检测结果。

11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于包括下述步骤：

11a)石蜡切片进行脱蜡与封闭：二甲苯Ⅰ、Ⅱ，梯度酒精：100％，95％，80％，70％处理；3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，蒸馏水清洗；

11b)将步骤11a)中的切片进行抗原修复：将切片置于10mM pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液中，于微波炉中加热沸腾加热，滴加5％BSA封闭，滴加所述的检测试剂孵育；

11c)将步骤11b)中切片PBS清洗3次，DAB显色；自来水充分冲洗，苏木素复染15-20秒，自来水冲洗返蓝；

11d)梯度酒精：80％，95％，100％脱水处理，二甲苯透明:Ⅰ、Ⅱ二甲苯；

11f)中性树脂封片，显微镜观察，检测信号强度。