[发明专利]一种检测样品中多聚泛素化信号的检测方法

说明书

本发明涉及生物样本中蛋白质泛素化修饰的高效、灵敏且特异的检测方法。本发明方法的泛素化修饰检测试剂，是由两个不同的泛素结合结构域串联而成的人工合成多肽(ThUBD)，且N端含有标签蛋白GST，通过GST标签与辣根过氧化物酶(HRP)或荧光素(Fluorescein)连接。该检测试剂与方法可以真实有效地检测甲醛固定石蜡包埋的组织样本(FFPE)中的泛素化信号，并实现对生物样本内源多聚泛素链信号的荧光成像分析。与商业化抗体法以及公布的泛素化信号检测方法，该发明方法具有高效、简洁、灵敏、特异的检测性能，可为细胞和组织内的泛素化蛋白调节的检测提供技术手段。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测泛素链信号的方法。

背景技术

蛋白质的泛素化修饰(Ubiquitination)是一种高度保守且过程可逆的翻译后修饰。在泛素化修饰形成过程中，泛素经由泛素活化酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的级联酶促反应，通过其C末端的甘氨酸羧基与蛋白质底物的赖氨酸ε-氨基共价连接。泛素本身含有的7个赖氨酸(Lys6，Lys11，Lys27，Lys29，Lys33，Lys48和Lys63)以及其N端的蛋氨酸(M1)可以继续被泛素分子共价修饰，形成8种不同连接方式的多聚泛素链。不同连接方式的泛素链具有不同的空间拓扑结构，可以被不同的泛素结合蛋白所识别进而介导不同的生物学功能。如最经典的K48链主要介导底物被26S蛋白酶体降解；K63泛素链则主要参与溶酶体的胞内运输、细胞内信号传导和DNA修复等非降解过程；非经典的线性泛素链(M1 chain)主要参与NF-κB激酶的激活等过程；K11泛素链引导内质网相关的蛋白质降解和细胞周期调控等过程。泛素化修饰纷繁复杂的结构特征与功能的多样性构成了精密的调控语言，称之为“泛素密码”。如何能够高效灵敏地检测泛素化蛋白上的泛素链信号具有重要的技术和应用需求。

多聚泛素链信号可以被细胞内的泛素化系统识别并传递，进而将修饰底物引导到蛋白酶体降解或者其他细胞器发挥功能。泛素化修饰功能的发挥依赖于信号重要传递者——含有泛素结合结构域(Ubiquitin binding domain,UBD)的蛋白质。研究表明在人的蛋白质组中存在250多个包含有UBD的泛素受体蛋白。根据其生化与结构特征可分为16类，UBD种类与结构的多样性决定了其与泛素结合的亲和力的多样性和特异性。不同的UBD结合泛素单体的能力存在很大差异，其解离常数(Kd)从2到750μM不等，UBD与泛素的识别机制决定了UBD与泛素及泛素链的结合能力与特异性。

利用人工表达泛素结合结构域UBD亲和纯化泛素化蛋白质成为有效的方法。Hjerpe等发现4个串联的UBA泛素结合结构域与泛素链的结合能力明显提高，而且能够保护多聚泛素化修饰，避免其被蛋白酶体降解及去泛素化酶的作用。Hikaru等改造Ub-ProT并结合酶切技术实现对泛素链长度与种类的分析。Shi等利用4个串联的UBA泛素结合结构域成功地从哺乳动物细胞中富集到许多原先未鉴定到的泛素化蛋白质。这些报道中均使用了单一的UBA结构域，在大规模泛素化蛋白质富集过程中，会根据所选择的泛素结合结构域的特性对不同泛素链修饰底物进行富集。高媛和李衍常等系统评价了不同UBD对泛素链的亲和能力与结合偏性，选择性组合不同的泛素结合结构域，构建了人工杂种蛋白，发展了高效、无偏性的串联杂合泛素结合结构域(Tandem hybrid ubiquitin binding domain,ThUBD)，实现对细胞或组织样本的内源泛素化蛋白的高效无偏性富集。申请号为201410323921.1的中国专利申请公开了该人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其应用。